小麦胚芽抗氧化肽的筛选及其在抗高糖诱导的氧化应激中的作用机制研究

Natural antioxidant peptides derived from many plant proteins are expected to be developed as new functional foods, because they are effective free radical scavengers and less toxic than synthetic antioxidant. Wheat germ protein hydrolysates have been shown to have antioxidant activities. However, the active structures of antioxidant peptides are unknown, and the molecular mechanisms of its anti-oxidation in vivo are not yet fully elucidated. Hyperglycemia-induced oxidative stress is highly related to the progression of atherosclerosis in diabetic patients. In the present study, highly active antioxidant peptides from the wheat germ albumin will be obtained by using a novel two-step dual-enzymatic hydrolysis and separation. They will be investigated in vitro and in vivo evaluation method, and the active structures of antioxidant peptides will be determined using functional proteomics. Utilizing vascular smooth muscle cells (VSMCs) in high glucose and diabetic animals (Hyperglycemia), the molecular mechanisms of its anti-oxidation and its role in diabetic atherosclerosis will be explored. In addition, the recombinant and cloning of protein gene with antioxidant peptide will be constructed and overexpressed in VSMCs. Protein kinase C (PKC) activation and Nox4 protein expression in the antioxidant protein overexpressing VSMCs will be the focus for exploring the molecular signaling pathway and further elucidating the role of antioxidant peptide in atherosclerosis. Using diabetic mice, we will clarify the role of the antioxidant peptides from wheat germ albumin in reducing hyperglycemia-induced ROS and ox-LDL level. Taken together, this study will have significant implications in understanding important molecular mechanisms of antioxidant peptides in diabetic atherosclerosis progression, and provide insight information for developing the anti-oxidant function of wheat germ and for its application in preventing diabetic atherosclerosis.

天然抗氧化肽由于安全，高效等特点，作为抗氧化功能因子，有望开发为新型功能食品。研究表明小麦胚芽蛋白酶解物具有抗氧化作用，然而，其活性抗氧化成分和体内抗氧化机理尚未完全明了。本研究将采用独创的二步双酶酶解技术并采用体内外抗氧化活性相结合的评价法，从小麦胚芽清蛋白中筛选出高活性的抗氧化肽，用质谱技术鉴定其活性结构。高血糖诱导的氧化应激是糖尿病并发症- - 动脉粥样硬化形成的主要机制。因此，本研究以高糖孵育的血管平滑肌细胞（SMCs）及糖尿病小鼠（高血糖）为氧化应激模型，以构建重组和克隆抗氧化肽蛋白的相关基因，并转染到SMCs为研究手段之一，以PKC/NOX4/ROS/ox-LDL这一动脉粥样硬化形成的关键环节为切入点，研究高活性抗氧化肽在高糖诱导的氧化应激中的作用并探讨其分子机制，为进一步开发小麦胚芽的抗氧化功能及其在抗动脉粥样硬化中的应用提供重要的理论基础。

人体内氧化产生的自由基与人的衰老和许多疾病有关。天然抗氧化肽由于安全，高效等特点，可以作为抗氧化功能因子，开发成新型功能性食品。研究表明麦胚蛋白酶解物具有抗氧化作用，然而，其活性抗氧化成分和体内抗氧化机理尚未完全明了。本研究的重要结果如下：. 首先，采用了独特的二步双酶酶解筛选技术，从麦胚清蛋白中筛选出了高活性的抗氧化肽，其氨基酸序列为AREGETVVPG，通过培养高糖诱导血管平滑肌细胞（VSMCs），发现该抗氧化肽能有效抑制高糖引起的VSMCs增殖过快，而且能有效降低高糖诱导细胞内的ROS、PKCζ活性和AKT磷酸化水平，达到与低糖环境下一致，表明其对高糖诱导的VSMCs增殖具有保护作用。此外，通过体外模拟胃肠道消化试验测定，结果显示了该抗氧化肽的稳定性。因此，本研究所建立的二步双酶酶解分离纯化/筛选技术为直接得到单一的高活性抗氧化肽提供了一种有效的工艺流程。 . 其次，在所筛选出的抗氧化肽AREGETVVPG的基础上，在C端经修饰增加蛋氨酸后得到了具有更高抗氧化活性的六肽AREGEM。该小肽可有效抑制高糖诱导的VSMCs增殖，阻滞细胞周期G1/S期转换，并显著提高细胞中的总抗氧化能力，GSH-Px和SOD酶水平，降低细胞中MDA水平，减弱高糖环境抑制VSMCs凋亡的作用。因此，本研究得到的抗氧化肽AREGEM，不仅能抑制高糖诱导的VSMCs异常增殖、而且可以调节高糖环境下VSMCs的凋亡，最终使其趋于正常状态，有望被开发成抗糖尿病患者动脉粥样硬化的候选药物。. 最后，我们的研究表明，高血糖使得p62蛋白表达量增加，从而诱导信号蛋白的关键复合物p62/PKCζ形成，并促使PDK1磷酸化 PKCζ，使得PKCζ的活性增强；活化的PKCζ能磷酸化p65 rel Ser311，然后激活NF-ĸB，导致NOX4的表达量增加。在VSMC中，NOX4的表达量增加，能促使Src激酶的氧化，从而激活下流的PI3K和MAPK的信号通道，导致了VSMC的异常增殖，从而使糖尿病患者引发糖尿病并发症。. 综上所述，本研究建立了独特的二步双酶酶解筛选技术，有效地从麦胚中筛选出高活性抗氧化肽。此外，本研究既阐明了糖尿病动脉粥样硬化形成的机制，又为进一步开发麦胚抗氧化功能及其在抗动脉粥样硬化中的应用提供了重要的理论依据。