基于能量回补调控的戴尔根霉高产苹果酸关键途径改造研究

Malic acid, as important organic acid and a platform chemical in several domains, has been paid more attention on its one-step fermentation instead of chemical industrial synthesis. With pre-screened Rhizopus delemar as producing strain, has the advantage of productivity of malic acid by co-fermentation of pentose and hexose, however, the strain defect fumarase, meanwhile, secrete the by-products of fumaric acid which associated with the process of energy production in the glyoxylae cycle. Based on this, we will focus on getting high-productivity of malic acid by reconstructing critical path and researching the energy recharge, the emphasis of this study as following: ①Reconstruction for key pathways: By using shuttle expression vector, we introduce the expressed genes of fumarase, and try to introduce metabolic flux of fumaric acid into malic acid. Or to block the up-stream key enzyme of fumaric acid including citrate-synthase and isoaconitate hydratase by recombinanting site-directed mutant、knockouting of the suicide vector genes and breeding. ②Regulation for energy compensation: Approach to inhibit may lead to lack of energy, we will plan to enhance the ability to produce NADPH by G6PDH pathway which associated with the shuttle branch and promote the energy recharge of cell. And then control malic enzyme and malate synthase, and to accelerate the flux of malic acid and analysis of changes in metabolic flux distributions. The project is expected to provide theoretical and technical support for one-step preparation of malic acid.

苹果酸是最重要有机酸及平台化学品之一，受广泛应用，目前的苹果酸制备采用的化工合成法及两步发酵法均受原料及转化率限制，采用纤维质水解糖一步发酵高产苹果酸，具重要意义。..前期筛得一株能五六碳共发酵主产苹果酸的戴尔根霉，该菌的"缺失了富马酸酶的"乙醛酸循环在"产能"的同时分泌副产物富马酸，基于此，项目拟围绕乙醛酸循环与苹果酸合成的碳代谢关系及能量代谢关系重点研究：①乙醛酸循环与苹果酸合成的碳代谢关系研究：采用同步辐射大量诱变结合氟柠檬酸抗性筛选陷型菌株，尝试降低选育副产物富马酸的流量；改善主产物与副产物的代谢分配比，分析相关关键酶基因。②乙醛酸循环与苹果酸合成的能量代谢关系研究：基于富马酸代谢阻断可能导致能量不足的特点，调控（G6PDH酶活调控）控制HMP/EMP穿梭通量，提升此穿梭支路伴生NADPH能力，促进细胞能量的回补；分析细胞代谢网络的整体碳代谢与能量代谢分布变化。..项目期望为纤维质糖一步法高产苹果酸提供技术及理论支持。

背景与意义：苹果酸是最重要有机酸及平台化学品之一，目前的苹果酸制备采用的化工合成法及两步发酵法均受原料及转化率限制，采用纤维质水解糖一步发酵高产苹果酸具重要意义。. 方向与及效果：分析发现戴尔根霉具有五六碳共发酵特征，该菌在缺失了富马酸酶的基础上，其乙醛酸循环在产能的同时分泌副产物富马酸，基于此，项目围绕乙醛酸循环与苹果酸合成的碳代谢关系及能量代谢关系开展了重点研究，降低了副产物提升了产物流量。. 主要研究内容：①乙醛酸循环与苹果酸合成的碳代谢关系研究：采用同步辐射大量诱变结合氟柠檬酸抗性筛选陷型菌株，降低了副产物富马酸的流量，改善了主产物与副产物的代谢分配比，并分析相关关键酶基因。②乙醛酸循环与苹果酸合成的能量代谢关系研究：基于富马酸代谢阻断可能导致能量不足的特点，调控了G6PDH酶活控制HMP/EMP穿梭通量，提升了此穿梭支路伴生NADPH能力，促进细胞能量的回补，进而促进产物通量。. 关键研究数据：采用软X射线诱变突变株，选择7 g/L氟乙酸进行诱变筛选，挑取那些在此条件下能够生长的缺陷型突变株。对突变株分析苹果酸产量提升超过由60 g/L，副产物富马酸产量明显减少，木糖代谢途径得到增强。突变株的ACO（乌头酸水合酶）及G6PDH（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）基因序列收录号分别是KF060240、KF041003。G6PDH关键酶可以提供2倍还原性力H（NADPH），以此来弥补突变菌株中乙醛循环中丢失的还原性H(NAD和FADH)，且增加PPP途径的代谢通量。G6PDH能提供木糖还原酶、苹果酸酶催化过程中的NADPH需要的关键辅助因子，所以通过活化G6PDH增强了木糖与苹果酸酶代谢。复合突变株苹果酸代谢通量增加了55.76%，能量系统的调控也促进苹果酸产量得到了提高，苹果酸速率 1.6 g/（L•h）以上。. 重要研究结果：本研究开展过程中，主要成果均是围绕菌株五六碳共发酵、代谢分析、能量调控、途径选育以及工艺探索而开展的，围绕这几个方面形成主要成果：获取优良突变株1株、新专利8个（授权2个）、新基因5个、发表论文14篇（SCI论文6篇，其余为EI或中文核心）、培养研究生2名、出国访学1人。本项目主要研究结果也进一步促进了食用及化学品苹果酸的开发热潮，为苹果酸生产的理论研究及工业实践均提供有益参考。