TET双加氧酶家族对颞叶癫痫发生的表观遗传学调控作用及其机制研究

Epilepsy is a common and refractory neurological disorder that affects about 1% worldwide people, but the cellular and molecular mechanisms underlying limbic epileptogenesis remain largely unclear. Recent emerging evidences imply that dysregulation of epigenetic mechanisms such as DNA methylation occurs in several human epilepsy syndromes. Our preliminary data has shown that DNA demethylase TET1 and TET3 can be regulated by limbic seizure activity. In order to further clarify the involvement of TET dioxygenases in pathogenesis of epilepsy, we will perform a series of pharmacological, molecular biological and genetical research to systematically analyze and dissect out the possible roles of TET dioxygenase in limbic epileptogenesis, using classic animal models of limbic epilepsy. We will also be focused on the epigenetic effect caused by the changes in gene expression of Tet, and try to explore the underlying cellular and circuit mechanisms which may importantly account for the regulation of limbic epileptogenesis. In detail, we will also analyze the changes in 5mC hydroxylation levels, the process of DNA demethylation, and the related gene transcription regulation mechanisms which is regulated by TET dioxygenases. The work proposed in this project will first provide direct in vivo evidences for the action of TET dioxygenase in epileptic brain, underscore the importance of TET-mediated DNA demethylation during the process of epileptogenesis, and provide insight into the epigenetic mechanisms of limbic epilepsy. Fruthermore, the anticipated outcome will shed light on novel therapeutic targets and strategies against epilepsy that is based on the related findings.

癫痫是一种常见的慢性破坏性脑部疾病，但目前颞叶癫痫的发病机制在很大程度上仍不够明晰。我们根据最新研究进展推测DNA甲基化修饰的表观遗传机制与颞叶癫痫发病过程有关。初步数据表明DNA去甲基化酶TET1和TET3 的基因表达可受到颞叶癫痫活动的调节。为深入研究TET双加氧酶家族在癫痫脑内的功能和相关机制，我们将采用分子生物学、细胞形态学和表观遗传学的方法观察TET1/2/3在颞叶癫痫发生中的表达情况及引起的DNA去甲基化过程变化；使用病毒感染、药理干预、基因敲除小鼠等手段探索它们对颞叶癫痫发生的具体作用；用Cre/loxP介导的条件性基因敲除手段来阐明TET发挥作用的细胞和环路机制，结合质谱和基因芯片技术来分析特定基因座DNA修饰和基因转录调节的改变以探讨分子机制。这将增进我们对TET双加氧酶功能和颞叶癫痫发病机制的理解认识，为从表观遗传学角度寻找防治癫痫的新策略提供科学依据。

癫痫是世界卫生组织提出重点防治的五大神经精神疾病之一，是一种慢性破坏性脑病，其中颞叶癫痫是最为常见的难治性癫痫，但其发病机制仍不明晰。本项目结合药理学、遗传学、细胞学、组织学、分子生物学等各方面的手段，主要完成了三部分研究任务：首先，发现成年脑内Tet1和Tet3的基因表达可响应癫痫发作活动的诱导，Tet1和Tet3在癫痫发作前后具有不同的时程变化规律和特异性的空间分布特征，而Tet2的基因表达在癫痫发作前后没有变化，与此同时，BDNF等基因的启动子区域胞嘧啶的去甲基化水平也在癫痫发作后4小时内升高；其次，成功制备了Tet1-KO、Tet2-KO、Tet3-KO、Tet1/3-double KO等一系列Tet基因突变小鼠，分别观察了癫痫发生过程中发作易感性、癫痫发作进程速度、癫痫样放电的时程变化等方面的情况，结果显示，各个KO小鼠与WT同窝对照相比，癫痫易感性无显著性差异，但是Tet1、Tet3基因单独敲除或者双重敲除后，癫痫发作进程和癫痫样放电时程均显著降低，而敲除Tet2基因则不影响癫痫发生进程，这些结果揭示了Tet蛋白在癫痫发病过程中发挥着不同的调节作用，为探索颞叶癫痫的表观遗传学调控机制提供了潜在的切入点；接着，用Cre/LoxP系统介导的cKO策略，分别在Emx、CaMKIIα、VGAT、Prox1阳性的神经元中分别敲除Tet1和Tet3蛋白，或者同时敲除Tet蛋白，观察不同脑内细胞中敲除Tet蛋白后颞叶癫痫发生的变化情况，发现在Prox1阳性神经元中敲除Tet蛋白后，癫痫发作进程和癫痫样放电时程变短，提示海马DG区神经元中Tet加氧酶在颞叶癫痫发生中的关键作用，揭示了Tet调控癫痫发生的一个关键细胞环路；还用癫痫脑组织样品对癫痫脑内Tet蛋白所介导的DNA去甲基化及相应的基因转录水平的变化进行分析，针对多个靶基因的启动子位点进行了甲基化/去甲基化分析，发现提供分子机制上的解释。本项目的工作有助于阐明TET发挥作用的分子和细胞机制，增进了我们对TET双加氧酶家族在脑内功能的了解，并从表观遗传学的角度拓展了大家对颞叶癫痫发生调节机制的认识，为癫痫研究和寻找防治癫痫新策略提供了新的科学依据。