黄瓜韧皮部筛管中的动蛋白的鉴定与功能研究

韧皮部运输在作物的器官联系及产量形成中发挥着重要作用。被动运输机制-压力流动学说是目前广泛接受的韧皮部运输机制。但有研究证明韧皮部运输中也消耗三磷酸腺苷（ATP），可能同时存在主动运输。微管马达蛋白-动蛋白是细胞中消耗ATP的物质运输的重要动力。之前研究表明，芹菜的韧皮部筛管中存在微管蛋白和动蛋白；动蛋白主要位于筛管的P-蛋白丝上。黄瓜是韧皮部研究的模式植物，本项目拟以此为基础，利用微管垂钓、SDS梯度凝胶电泳和液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）等方法鉴定韧皮部筛管中的动蛋白；克隆动蛋白基因，原核表达动蛋白特异片段并制备抗体，通过免疫荧光标记和瞬时表达明确其组织和亚细胞定位；构建黄瓜cDNA文库，筛选该动蛋白的互作蛋白，进而推测其功能。研究动蛋白在黄瓜韧皮部运输中的作用，不仅具有重要的理论意义，而且由于涉及作物产量形成和农药传导，因此也具有重要的实际意义。

提取黄瓜韧皮部液蛋白，通过微管共沉淀实验，结合LC-MS/MS鉴定了黄瓜韧皮部液中的三个马达蛋白——Kinesin蛋白。表达分析结果显示，该蛋白在所有组织中都有表达，但是在果实中优势表达，并且随果实发育表达量特异上调。暗示黄瓜可以通过韧皮部Kinesin的运输，整体的系统调控果实的发育。进一步研究了Kinesin在果实发育中的表达模式，与不同果实大小的黄瓜果实生长参数的相关性证明Kinesin参与了黄瓜果实早期发育过程中细胞快速分裂和细胞膨大过程。克隆了Kinesin基因，体外验证了这三个Kinesin蛋白的微管结合活性和ATPase活性，证明三个Kinesin是有功能的蛋白。通过制备抗体，结合原生质体瞬时表达，western-blot以及免疫荧光标记实验，证明了CsKinesin1参与了黄瓜果实早期细胞的快速膨大，CsKinesin2参与了黄瓜果实叶绿体的分裂，CsKinesin3参与了黄瓜果实快速分裂末期成膜体的建成。研究证明了微管马达蛋白在黄瓜果实发育中的重要作用。