拟南芥隐花色素CRY2在介导蓝光依赖的生物钟调控中的作用机理研究

Arabidopsis Cryptochromes (CRYs) are photolyase-like blue light photoreceptors, which mediate the blue light-dependent responses in plants through interacting with regulators of transcription or protein degradation to modulate the expression of downstream genes. The Arabidopsis circadian clock system is an endogenous time-keeping mechanism, which mainly consists of multiple interlocked transcriptional feedback loops. The previous genetic evidence showed a clear role of CRYs in the light-dependent regulation of circadian clock, however, with so far unknown mechanisms. In the yeast-two-hybrid library screen with CRY2 as the bait, we isolated PSEUDORESPONSE REGULATOR5 (PRR5) as a CRY2-interacting protein. PSEUDORESPONSE REGULATORs (PRRs) comprise five members that are essential to the function of the central oscillator. TOC1/PRR1, PRR5, PRR7 and PRR9 could help to establish the circadian expression of core clock genes LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY) and CIRCADIAN CLOCK ASSOCITATED 1 (CCA1) by their transcriptional repression activities. In this study, we plan to start with the analysis of the protein interactions between CRY2 with PRR proteins, and explain how CRYs affect the activities of PRR proteins in circadian clock regulation. Our study would lead the way to the underlying mechanism how CRYs play in the blue light-dependent regulation of the circadian clock.

拟南芥隐花色素蛋白Cryptochrom（CRY）作为蓝光受体的一类，可以通过与信号蛋白互作来调控下游基因的表达，从而介导植物对蓝光的响应。而生物钟是植物内源的分子计时机制，主要由多个互相连锁的转录负反馈环构成。遗传证据表明CRY可以参与光对生物钟系统的调控，但关于其作用方式和机制至今尚不清楚。本实验室通过筛选拟南芥酵母双杂交文库得到能够与CRY2特异在蓝光下互作的生物钟蛋白PRR5，其是PRR蛋白家族5个成员之一（TOC1/PRR1、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9），其中TOC1、PRR5、PRR7和PRR9可以通过其转录抑制活性限制核心振荡器基因LHY和CCA1表达的时间，从而维持核心振荡器的正常功能。本研究拟从分析隐花色素CRY2与PRR蛋白间的互作关系着手，深入研究CRY在PRR蛋白在调控生物钟基因表达中的作用，初步阐明隐花色素在介导蓝光信号调控生物钟过程中的作用机制。

隐花色素主要通过与信号蛋白发生蓝光特异的互作，直接或间接地调控下游基因的表达来介导光信号的传导，所以我们推测CRY2可能通过与PRR5互作来介导蓝光对生物钟基因表达的调控。结合目前掌握的信息，我们假设CRY2可以在蓝光下与PRR蛋白结合，将转录抑制因子竞争下来，最终解除其对下游生物钟基因表达的抑制。因此，本项目全面分析拟南芥隐花色素CRY2与PRR蛋白间的相互作用，深入分析CRY2在PRR蛋白调控生物钟基因表达中的作用，进而初步阐明隐花色素在蓝光依赖的生物钟调控中的功能及作用机理，丰富和深化对隐花色素生理功能及其分子机制的认识，为进一步利用生物钟进行作物改良开辟新的思路。.通过本项目的实施，我们获得了研究蛋白互作十分有用的双基因过表达载体，明确了CRY2与PRR5蛋白在酵母中互作，是蓝光特异的，作用的强度随光强，时间增加而增大，CRY2蛋白N端489个aa和PRR5蛋白C端359-661位aa为二者的互作区域。生物信息学对比PRR蛋白序列发现，PRR5,7,9具有位于PRR蛋白的C端特异的EAR motif（L-X-L-X-L）,而PRR3不含EAR motif，无论在黑暗还是蓝光下CRY2在酵母中均不能与其任何片段进行互作。通过HEK293蛋白互作系统证实PRR5、PRR7、PRR9在中都能与CRY2发生互作。另外我们发现CRY2的蛋白激酶PPK能够磷酸化PRR9。PRR5、PRR7、PRR9在长日照蓝光下有着与长日照白光下类似的表达节律。进一步研究CRY2的作用机理，我们发现CRY2多聚化发生很快，依赖蓝光光强，在黑暗中是可逆的。而CRY2的多聚化是其功能的必要但非充分条件。这些结果对于利用生物钟进行作物改良开辟新的思路。