基于大肠杆菌胞外分泌表达能力的调控元件研究

大肠杆菌表达体系已广泛用于工业用酶及活性蛋白的生产；然而表达的外源蛋白容易形成包涵体，分泌表达也往往只到周质空间，表达产物的获取需要后续的破碎、复性及纯化等繁琐的工艺，或胞外表达量低等技术瓶颈；本研究以偶然发现的介导胞外表达的新型信号肽为契机，深入了解信号肽、前肽及融合蛋白序列及结构特征对分泌表达能力的影响规律；分析典型蛋白（绿色荧光蛋白、脂肪酶、糖苷酶或人白介素-2等）的蛋白质氨基酸序列与结构对分泌表达的影响，发现并设计新的大肠杆菌高效胞外表达信号肽；深入了解共表达二硫键异构酶、胞外蛋白等分子伴侣对重组蛋白分泌表达能力的促进作用；分析并优化上述调控元件介导典型蛋白的胞外表达；为大肠杆菌高效胞外分泌表达新体系的构建提供理论指导。为工业生物技术的提升提供有效工具。

大肠杆菌是广泛应用的重组蛋白表达体系；由于大肠杆菌的双层膜结构重组蛋白常为胞内表达，且易形成无活性的包涵体沉淀，导致下游复性及分离纯化等工艺复杂而难以获得高纯度的重组蛋白产物。本项目设计了新型信号肽介导重组蛋白的胞外分泌表达，构建了具有分子伴侣作用的融合标签，有效实现了多种蛋白的分泌表达或可溶性表达。主要研究成果：.1) 本研究从极端微生物Arthrobacter arilaitensis首次发现了果糖苷酶β-fructofunanosidase的信号肽Frf53能介导该酶在大肠杆菌中实现高分泌表达，信号肽Frf53含有53个超长氨基酸序列：MERACVAVREIVRFHIE—QRQTIVNKQRTKRGILAAALSIGALGTLISGAMA。验证了超长信号肽N区（阴影部分）与其分泌能力相关，随着 N区氨基酸残基被截断数量的增多，信号肽的分泌能力逐渐减弱，且信号肽Frf53的N区存在重复模序。.2) 在信号肽Frf53的结构与功能研究的基础上，独创性地设计了强分泌性信号肽的增强小肽模序，模序的氨基酸序列通式：M(αXβYγ/αYβXγ)n，其中X代表酸性氨基酸；Y代表碱性氨基酸；α和β分别代表0-2个中性氨基酸；γ代表1-10个中性氨基酸； n为1-3重复模序。增强小肽模序具有显著增强典型信号肽OmpA及PelB的分泌表达能力，对部分重组蛋白其增强分泌表达的能力达十倍以上。.3)新型信号肽Frf53及其增强小肽模序结合信号肽介导蛋白跨膜转运的分泌途径；通过添加SecA抑制剂以及表达载体转化tat缺陷型大肠杆菌宿主的方法，推定信号肽Frf53介导蛋白跨膜转运到周质空间的途径为Sec途径。.4) 前肽及融合蛋白结构对模型蛋白在大肠杆菌中分泌表达能力的影响；将自行发现的高分泌表达的糖苷酶Fru6截断体作为融合标签，设计并构建了具有分子伴侣作用的融合表达载体pFru312，利用融合标签Fru312成功实现了外源蛋白水蛭素和葡聚糖酶的胞外分泌表达，以及血管内皮生长因子受体的可溶性表达。.5) 新型信号肽介导多种重组蛋白的胞外分泌表达及表达蛋白的高效生物催化应用；分析并优化相关调控元件，成功实现了介导重组蛋白的胞外分泌表达，果糖苷酶、葡聚糖酶、蛋白酶、水蛭素及血管内皮生长因子受体等，其中高效分泌表达的果糖苷酶、蛋白酶WQ9-2已经应用于葛根素、芒果苷以及内吗啡肽2的高效催化。