ox-CaMKII介导线粒体功能调节参与田蓟苷抗心肌缺血/再灌注损伤的机制研究

Dracocephalum moldavica L. is Xinjiang traditional Uyghur medicine, which is used to treat coronary heart disease in clinical. Previously research has shown that Tilianin is the main active component in Dracocephalum moldavica for treating coronary heart disease. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II(CaMKII) plays a key role in myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI) caused by calcium overloading and oxidative stress. We found Tilianin can interact with CaMKII by computer aided molecule simulation, and further certified the activity of CaMKII can be inhibited by Tilianin in vitro. However, it is still unclear how Tilianin inhibit the activity of CaMKII and whether anti-MIRI of Tilianin is directly related to inhibition of CaMKII. Based on analysis of CaMKII oxidation and phosphorylation intervened by Tilianin, myocardial cell apoptosis and mitochondrial function regulated by Tilianin, we want to illuminate molecular mechanism of Tilianin treat MIRI in cell and organ level. We will further confirm the molecular mechanism of Tilianin to MIRI by comparing with other compounds targeting different regions of CaMKII (such as oxidation and phosphorylation site), and then investigate the cross regulation between CaMKII oxidation and phosphorylation. Expect to provide new ideas and experimental basis for MIRI prevention and treatment.

香青兰是新疆特色维药，临床常用其治疗冠心病，项目组已证实田蓟苷是主要活性成分，具有明显抗心肌缺血/再灌注损伤（MIRI）作用。钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKII）在Ca2+超载或氧化应激导致MIRI过程中发挥重要作用，分子模拟发现田蓟苷与CaMKII有较强的相互作用，体外实验证明田蓟苷显著抑制CaMKII活性。但田蓟苷通过什么方式抑制CaMKII活性，其抗MIRI是否与抑制CaMKII直接相关，目前尚不明确。本项目拟在心肌细胞及离体心脏中研究田蓟苷对CaMKII的氧化/磷酸化相关信号通路调节，结合其对心肌细胞凋亡及心肌线粒体形态和功能影响，阐明田蓟苷抗MIRI的分子机理；通过比较田蓟苷与靶向CaMKII不同位点（如氧化或磷酸化等位点）抗MIRI的差异，在进一步确证田蓟苷抗MIRI分子机制的同时，探究CaMKII氧化和磷酸化的交互调控机制，为防治MIRI提供新思路和实验依据。

项目组已证实田蓟苷是香青兰主要活性成分，具有明显抗MIRI作用。钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）在Ca2+超载或氧化应激导致MIRI过程中发挥重要作用，分子模拟发现田蓟苷与CaMKII有较强的相互作用，体外实验证明田蓟苷显著抑制CaMKII活性。在前期工作基础上，本项目以CaMKII为靶位结合线粒体相关分析对田蓟苷防治MIRI的心肌保护机制进行系统研究。.通过减少氧气和糖供给造成急性心肌细胞缺氧缺糖，在预定时间内恢复氧及正常含糖培养基供应的方法建立OGD/R的H9c2细胞模型。流式细胞仪检测发现田蓟苷可明显降低OGD/R诱导H9c2细胞凋亡率、线粒体内Mito ROS水平、钙离子浓度，明显升高线粒体膜电位。运用TUNEL等凋亡检测方法和Western blot技术证实田蓟苷经由ox-CaMKII/PI3K/AKT及cytochrome c/bcl-2/caspase-3/9凋亡信号途径保护心肌细胞免受缺血再灌注损伤。蛋白免疫印迹法发现田蓟苷可明显上调OGD/R模型细胞 p-CaMKII和VDAC功能蛋白的表达，明显下调促发线粒体途径细胞凋亡相关的p-AKT、BAX、DRP1蛋白的表达，明显上调抑制线粒体途径细胞凋亡相关的Bcl-2和MFN2蛋白的表达。.雄性SD大鼠为实验对象，通过心脏超声观察心脏结构、功能及心肌梗死面积，结果田蓟苷可降低IS/AAR，减少心肌梗死面积。荧光酶标仪、ELISA法检测结果田蓟苷可降低大鼠ROS Fluorescence、MDA、LDH、SDH、Succinate水平，升高SOD水平。HE染色检测心肌组织显示田蓟苷可减轻I/R大鼠模型心肌细胞水肿、断裂、坏死程度及间质炎细胞浸润程度。采用TUNEL法检测结果田蓟苷可明显降低大鼠心肌组织凋亡率。Western blot检测心肌组织相关蛋白水平的表达，结果与I/R模型组相比，高剂量组大鼠心肌组织DRP1、VDAC、p-CaMKII、p-AKT、Bax、p-ASK1、p-p38和CHOP蛋白水平明显降低，而MFN2和Bcl-2蛋白水平明显升高。TEM检测发现田蓟苷可降低大鼠心肌组织中线粒体空泡率，增加排列的整齐性。.综上可知田蓟苷通过保护线粒体功能，抑制线粒体途径细胞凋亡和内质网应激发挥改善MIRI作用；通过改善大鼠MIRI可能与调控线粒体途径和内质网应激途径抑制心肌细胞的凋亡有关。