从Ghrelin-能量代谢途径研究熟大黄胰腺靶向成分促AR42J细胞再生的分子机制

Translational research combined clinical problems with basic scientific research to solve the clinical problems as the target. How to promote the pancreatic tissues regeneration is the clinical problem of our translational research. We have comfirmed that Cooked Rhubarb could promote the pancreas regeneration and alleviate the mitochondria injury after acute pancreatitis(AP). Especially, in AP model, tissue distribution of Cooked Rhubarb is targeted at the pancreas. The pancreas-targeted ingredients of rhubarb are emodin, rhein and chrysophanol. But the underlying mechanism and the bioactive substance of Cooked Rhubarb is unknown. So, guided by the translational research, based on the fact that Ghrelin mediated energy metabolism, we use HPLC and molecular biological methods to detect the protein expression of ERK, PI3K/AKT, energy metabolism enzyme activity and the change of mitochondrial structure and function. Screening the target points which they have effects on and the bioactive substance of Cooked Rhubarb, we would clarify their dose-effect and time-effect relationship. Studying the molecular mechanism of promoting regeneration effect of Cooked Rhubarb is helpful to putting the translational research method into the field of Chinese medicine.

转化研究是将临床问题与基础科研相结合以最终解决临床问题的研究方法。如何促进急性胰腺炎（AP）后胰腺组织再生以防止疾病慢性化是我们进行转化研究的临床问题。前一项目证实熟大黄具有促AP后胰腺组织再生、尤其改善线粒体结构损伤的药效；且发现在AP病理状态下，熟大黄显示出以胰腺组织为靶器官的体内分布特点。基于熟大黄的胰腺靶向成分已明确，但其促再生的药效物质不清，确切机理不明。这就迫切需要我们以转化医学的思路，从熟大黄及其靶向成分调控离体AR42J腺泡细胞增殖作用出发，着眼于Ghrelin介导的线粒体能量代谢途径，运用HPLC及分子生物学手段，围绕ERK、PI3K/AKT信号通路、以能量代谢关键酶和线粒体结构、功能作指标，筛选熟大黄作用的分子靶点和药效物质；并以此靶点阐明熟大黄及其靶向成分促胰腺再生的量-效、时-效关系。以熟大黄促AP后胰腺再生为契机，将转化研究的新方法引入中医药研究领域。

背景：.1).大承气汤能减轻急性胰腺炎病情，促进炎性损伤胰腺再生修复，但药理学机理不清楚；.2).能量代谢变化决定细胞死亡模式和炎症反应严重程度，在急性胰腺炎发展及修复再生过程中均发挥着重要作用。.研究内容：.通过能量代谢途径研究大承气汤来源单体成分大黄酸保护损伤胰腺促进修复再生的分子机制。.1). 筛选大承气汤在急性胰腺炎大鼠胰腺组织内有效药物单体成分； .2). 研究大承气汤中大黄酸单体保护急性胰腺炎小鼠损伤胰腺促进修复再生的整体效应；.3). 基于能量代谢调节酶AMPK探索大黄酸单体对损伤胰腺细胞保护效应及机制；.4). 基于线粒体及PI3K/Akt/mTOR蛋白合成通路探索大黄酸单体促进损伤胰腺AR42J细胞修复再生分子机制。.重要结果：.1). 在体实验结果显示大承气汤大部分单体成分均能吸收入胰腺组织，呈剂量依赖，以大黄酸组织内浓度最高。大承气汤能够明显抑制模型大鼠胰腺组织内炎症反应，减轻病理损伤。.2). 在体实验结果显示大黄酸能够明显降低模型小鼠血淀粉酶分泌,促进IL-10并抑制TNF-a和IL-6表达而调控炎症反应；改善胰腺病理损伤（p<0.05）及线粒体结构损伤，诱导胰腺组织再生（TGF-β及Ki67表达提高，p<0.05）。.3). 离体实验结果显示大黄酸单体能够有效抑制胰腺腺泡原代细胞及胰腺小叶组织胰蛋白酶及淀粉酶过度分泌（p<0.05），增加细胞活性（MTT增加，LDH减少），以0.5uM及1.0uM大黄酸效果最好（p<0.05）；低速离心后的大黄酸干预的上清液样本中AMPK活性增加，但高速离心后的大黄酸干预的上清液样本中AMPK活性没有明显变化。.4). 离体实验结果显示大黄酸单体能够明显减轻雨蛙肽刺激的胰腺AR42J细胞线粒体结构损伤，调节呼吸复合酶活性及膜电位异常变化，改善线粒体功能；通过增加Ghrelin蛋白表达,抑制AMPK活性，提高PI3K,Akt，mTOR及p70S6k活性, 从而促进蛋白合成及细胞修复再生。.意义：大承气汤主要单体成分大黄酸可能是最代表母方疗效的活性成分，本课题为创制中药新药提供依据。