猪瘟病毒NS5A蛋白结构与功能关系的研究

猪瘟是养猪业的毁灭性传染病，在我国仍然非常严重。病毒的NS5A蛋白在病毒的复制、翻译及其转换中的作用及其相关的结构都没有得到很好的研究。本项目改造现有的病毒基因组复制子，优化反应体系，形成用于研究猪瘟病毒复制和翻译的双功能系统；用基于蛋白质和蛋白质、蛋白质和核酸相互作用的自由能变化的生物信息学方法，结合定点诱变， 表达和互补分析等技术，在以上双功能系统的背景下，挖掘出NS5A蛋白中影响病毒复制、病毒RNA合成和蛋白质翻译的活性中心和结构成分；结合免疫沉淀、竞争性结合、酵母双杂交系统和凝胶阻滞分析等实验技术，研究NS5A蛋白与病毒其它重要蛋白，与病毒调节复制和翻译位点的相互作用，找出NS5A蛋白在猪瘟病毒复制与翻译及其相互转换中的作用及其相关的结构成分。综合以上结果，基本阐明NS5A蛋白结构与功能的关系。该项目可望从一个新的角度揭示猪瘟病毒的复制和翻译的机制，为开发抗病毒新药增添新靶标。

猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV) 是传染病-猪瘟的病原体。NS5A蛋白是猪瘟病毒非常重要的蛋白质， 但NS5A蛋白在病毒的复制、翻译及其转换中的作用及其相关的结构都没有得到很好的研究。因此， 我们申请并获得了“猪瘟病毒NS5A蛋白结构与功能关系的研究”的基金项目。在该项目的资助下，我们改造现有的病毒基因组复制子，优化反应体系，形成用于研究猪瘟病毒复制和翻译的双功能系统；利用该系统， 我们发现NS5A在浓度小的时候促进病毒基因组的合成，在浓度高的时候抑制病毒基因组的合成。猪瘟病毒NS5A和NS5B蛋白都能结合在3’UTR上， 但NS5A结合在3’UTR上比NS5B蛋白要强。实验结果还证明NS5A能直接结合在NS5B（病毒的复制酶）上，通过与该复制酶和3’UTR的结合，调节猪瘟病毒的复制和翻译，NS5B蛋白也能通过与NS5A的结合减轻NS5A对病毒IRES介导的翻译的抑制作用。进一步的工作证明，NS5A是一个对病毒组装与释放非常关键的蛋白，能结合病毒的C蛋白，通过与C蛋白的结合调节猪瘟病毒的组装与释放。除此之外，我们还发现宿主细胞RNA解旋酶A也能调节猪瘟病毒的复制和翻译。最后，我们还研究了NS3与NS5B 蛋白的相互作用以及对病毒复制酶活性的促进作用。在实施该项目时，改善了一些分子生物学方法，将这些方法应用其它农业微生物学领域也获得了比较好的成绩。在该项目（31070671）的资助下，这些结果已经发表在10篇SCI文章上。对比计划书规定的目标，我们已经完成了本项目的各项工作。