大鼠浅筋膜中腺苷受体与针刺镇痛相关性研究

We will use the ordinary SD rats to study on superficial fascia morphology before and after acupuncture. We will observe the change of A3 adenosine receptor, intracellular second messenger such as cAMP and calcium. We will also assess the effect of Epac, RasERK 1/2 and other signaling proteins in primary cultured rat fibroblasts (RSF-Fibroblasts). We will design, synthesize and transfect siRNA into RSF-Fibroblasts, to observe A3 adenosine receptor-mediated effects of cAMP, Epac, Ras and ERK 1/2 and other signaling proteins. We hope to explain the important role of A3 adenosine in acupuncture analgesia from whole cell gene and protein expression levels. By animal and cell models, up-regulation and silence of A3 adenosine receptors, and a series of adenosine A3 receptor agonists and antagonists , we expect to explore the mechanism of acupuncture inhibition of pain.

本课题设计以普通SD大鼠及腺苷A3受体基因转染大鼠为研究对象，观察针刺前后穴位区、非穴位区的浅筋膜形态学、腺苷A3受体、胞内第二信使cAMP、Epac、RasERK 1/2以及钙离子等信号蛋白的变化，并以原代培养大鼠浅筋膜成纤维细胞（RSF-Fibroblasts）、经 siRNA转染的RSF-Fibroblasts为对象，观察针刺对腺苷A3受体介导的 cAMP、Epac、Ras及ERK 1/2等信号蛋白的影响。从整体、细胞和基因蛋白表达层面明确浅筋膜在针刺镇痛中的重要作用。通过上调与沉默腺苷A3受体的动物及细胞模型，以及观察一系列腺苷A3受体的激动剂和拮抗剂对针刺镇痛的影响， 探讨针刺镇痛的作用机制。

浅筋膜可能通过释放腺苷作用于腺苷受体，并在针刺镇痛中发挥着非常重要的作用。本课题设计以SD大鼠为研究对象，观察针刺前后穴位区的浅筋膜形态学、腺苷A3受体、胞内第二信使cAMP、Epac、RasERK 1/2以及钙离子等信号蛋白的变化，并以原代培养大鼠浅筋膜成纤维细胞（RSF-Fibroblasts）、经 siRNA转染的RSF-Fibroblasts为对象，观察针刺对腺苷A3受体介导的 cAMP、Epac、Ras及ERK 1/2等信号蛋白的影响。通过上调与沉默腺苷A3受体的细胞模型，以及观察腺苷A3受体的激动剂和拮抗剂对针刺镇痛的影响，探讨针刺镇痛的作用机制。第一部分HE染色显示针刺足三里浅筋膜组织细胞排列紊乱，有细胞脱落现象。Masson染色显示，针刺足三里浅筋膜组织细胞排列紊乱，轻微纤维沉积。Real -Time PCR和Western blot显示，针刺足三里穴位可明显增加浅筋膜中腺苷A3受体表达，降低浅筋膜中CAMP、Epac表达，P-P38、P-ERK表达均明显上调。第二部分腺苷A3受体在脊髓、脑干、丘脑、大脑皮层和浅筋膜均高丰度表达，拮抗剂Reversine可逆转针刺镇痛的效果，而IB-MECA可增强这一效果。Reversine可上调cAMP、Epac蛋白表达，下调Ras、ERK 1/2和P38蛋白磷酸化；相反，IB-MECA可下调cAMP、Epac蛋白表达，上调Ras、ERK 1/2和P38蛋白磷酸化。第三部分沉默腺苷A3受体对浅筋膜成纤维细胞CAMP、Epac mRNA表达上调，Ras、ERK、P38 mRNA水平表达下调，CAMP、Epac蛋白表达上调，Ras、P-P38、P-ERK表达下调，P38、ERK未见明显影响。下调腺苷A3受体表达可减少细胞凋亡，IL-6表达上调，可减少Ca2+内流。第四部分适当的压力刺激可以促进大鼠“足三里”穴筋膜组织成纤维细胞增殖，免疫正相关因子、腺苷及腺苷受体表达增加以及MAPK通路活化。MAPK通路被抑制后，腺苷和腺苷受体以及免疫相关因子的表达亦相应地下调，同时抑制细胞增殖。由此得知腺苷-腺苷受体-MAPK信号通路之间的关系形成了一个循环的调控机制。本文实验表明腺苷A3受体参与针刺镇痛生理过程，激动腺苷A3受体可加强针刺镇痛的效果。本实验为临床针刺镇痛，尤其是炎症性疼痛的治疗提供理论依据。