裂殖酵母中Dma1通过泛素化修饰Tip1/CLIP-170参与调控细胞极性生长的分子机制研究

CLIP-170 belongs to the evolutionarily conserved microtubule plus-end tracking protein (+TIP) family, its function in regulating microtubule dynamics has been the focus of many studies. Recently, it has been found that the phosphorylation of mammalian CLIP-170 by AMPK kinase is involved in establishment of cellular polarity and cell migration regulation. CLIP-170 homologue in fission yeast, Tip1, is localized at microtubule plus ends and cell tips, it functions in controlling polar growth. Our preliminary results revealed the connection between E3 ubiquitin ligase Dma1 and Tip1 in fission yeast:(1) Tip1 is present in the immunoprecipitated complex of purified Dma1-TAP; (2) Dma1 and Tip1 colocalize at cell tips; (3) Dma1 affects ubiquitination of Tip1, and deletion of dma1+ gene causes accumulation of Tip1 at cell ends. By employing molecular cell biology techniques, this project intends to further reveal the mechanism of how Dma1 regulates ubiquitination of Tip1 and its significance in polar growth. This will shed light on studies of polar growth promoted by CLIP-170 in higher eukaryotes. Recent studies in mammalian systems showed that deletion, upregulation or mislocalization of polarity proteins result in cancer, therefore, our study has not only significance in answering biological questions but also potential application in medicine.

进化上保守的微管正极末端示踪蛋白CLIP-170家族在调控微管动态组装方面的功能已被广泛研究。人们最近又发现哺乳动物AMPK激酶通过磷酸化CLIP-170参与细胞极性建立并调控细胞迁移。裂殖酵母中的CLIP-170同源蛋白Tip1存在于微管正极和细胞末端，与细胞极性生长调控有关。我们的预实验结果揭示了裂殖酵母E3泛素连接酶Dma1与Tip1的联系：(1)Tip1总是出现在串联亲和纯化的Dma1蛋白复合体中；(2)两蛋白在细胞末端共定位；(3)Dma1影响Tip1的泛素化及其在细胞端部的积累。本项目拟采用分子细胞生物学技术，进一步研究并阐明Dma1通过泛素化Tip1进而调控极性生长的分子机制，为高等生物中CLIP-170调控极性生长机制研究提供新思路。近年来的研究表明，细胞极性蛋白的缺失、表达上调或定位错误与癌症的发生和发展有关，因此，本研究将具有极其重要的生物学意义和潜在的医学应用价值。

细胞极性是大多数细胞的一个基本特征，细胞极性的建立是细胞周期中的重要事件。裂殖酵母S. pombe中的CLIP170家族蛋白Tip1能够监督微管使其沿着细胞的纵轴生长，并参与运输极性因子到达细胞端部的过程。人类肿瘤抑制因子Chfr同源蛋白Dma1是纺锤体检验点蛋白和胞质分裂的抑制因子。已有的研究发现它会泛素化修饰SIN (septation initiation network)通路中的Sid4，导致Plo1激酶不能定位到SPB (spindle pole body)，从而抑制SIN信号通路和阻止胞质分裂。. 我们实验室的前期结果显示Dma1除定位在胞质、SPB和中隔外，也定位在细胞生长端，并在细胞端部与Tip1共定位，两者在细胞内的相互作用也被证实，且Tip1的泛素化依赖于Dma1的E3泛素连接酶活性。本研究探讨了影响Dma1端部定位的可能因素，并通过大量突变体筛选，发现肌动蛋白斑的合成受阻会使Dma1端部定位的强度和范围扩大，并且Dma1的端部定位同时依赖于Tip1和Pob1两种蛋白。我们还证实了Dma1和Tip1的细胞内相互作用依赖于Dma1的FHA结构域。我们的研究发现强制增加细胞端部的Tip1会使细胞出现极性生长缺陷，而同时增强Dma1在细胞端部的定位则能够挽救这种极性生长缺陷表型。另外，我们还发现Tip1的T299和S302位点的磷酸化对于Tip1的泛素化是必需的。. 我们通过将Tip1中的全部25个Lys突变为Arg即（Tip125K25R）以去除Tip1的泛素化修饰，发现Tip1的泛素化修饰发生在多个赖氨酸位点，并且K244是其中的一个比较重要的一个位点。我们还发现，hhp2∆、tip13A和tip125K->25R突变体都会造成Tip1的端部积累，进而产生极性生长缺陷。这些结果说明Tip1的泛素化修饰会影响Tip1在细胞端部的动态水平进而调控细胞的极性生长，而这种泛素化修饰只介导一小部分Tip1的降解。. 综上所述，本研究提供了几个方面证据揭示出裂殖酵母Dma1通过泛素化Tip1参与细胞极性生长的可能机制，这对人们认识哺乳动物中极性生长调控机制具有重要的借鉴意义。