CRMP-2介导氨中毒时GABAA受体内吞机制的研究

Ammonia intoxication is the main mechanism of hepatic encephalopathy (HE). Hyperammonia leads to the increased level of brain GABA, then over-activated GABAA receptors induce net increase of inhibitory neurotransmission. To modulate the endocytosis of GABAA receptors can attenuate the symptoms of HE. Our results showed that: hyperammonia can interrupt the normal neuronal activity, induce epileptiform discharges. Overexpression of CRMP-2 can reduce ammonia induced epileptiform discharges. Whether or not CRMP-2 involves in AP2-clathrin mediated GABAA receptors endocytosis under hyperammonia? Accordingly, CRMP-2 was detected in the endocytic vesicle complex mediated by AP2-clathrin complex, we propose the hypothesis of CRMP-2 involved GABAA receptors endocytosis under hyperammonia. This project aims to setup the ammonia intoxication models, by morphological, molecular biological and electrophysiological studies, to get the evidence of ① interaction between CRMP-2 and AP2-clathrin complex; ② the mechanisms of CRMP-2 mediated GABAA receptor endocytosis; ③ whether CRMP-2 mediated GABAA receptor endocytosis can attenuate the neuronal symptoms of HE. This study will help to further understand the neuronal dysfunctional basics of HE and provide theoretical basis and new insight for clinical treatment of HE.

氨中毒是肝性脑病发生的主要原因。高血氨致脑内GABA堆积、GABAA受体过度激活可引起神经抑制，调控GABAA受体是改善肝性脑病神经症状的有效途径。前期研究证实，高血氨诱发神经元产生癫痫样放电，但CRMP-2可抵抗高血氨诱导的神经元放电；CRMP-2是否通过GABAA受体内吞机制介导高血氨诱发的神经元放电？由于CRMP-2存在于介导GABAA受体内吞的AP2-clathrin复合物内吞囊泡中，我们提出CRMP-2参与氨中毒GABAA受体内吞的假说。本项目通过形态学、分子生物学、电生理学等技术，探讨：①CRMP-2是否与AP2-clathrin复合物相互作用；②CRMP-2如何介导氨中毒GABAA受体的内吞；③CRMP-2介导的GABAA受体内吞是否能缓解肝性脑病神经症状；从而揭示CRMP-2在氨中毒时GABAA受体内吞中的机制，为阐明肝性脑病神经功能障碍的机制及临床治疗提供新的思路和靶标。

氨中毒是肝性脑病发生的主要原因。高氨导致脑内神经元兴奋和抑制的失衡，抑制性GABA受体和兴奋性AMPA受体的改变是介导神经元兴奋抑制失衡的重要原因，本项目通过pulldown、免疫共沉淀、免疫荧光、细胞膜片钳、动物行为学等手段在高氨诱导的氨中毒神经元模型以及亚急性肝性脑病小鼠模型上研究了坍塌反应调节蛋白2 (collapsin response mediator proteins 2, CRMP2)在其中发挥的作用，研究发现高氨可导致神经元树突棘密度和成熟度的降低以及神经元突触传递功能的降低，同时高氨促进了CRMP2磷酸化水平的增高，主要为GSK-3β对应的T514位点磷酸化水平的增高。进一步通过对神经元表面受体的免疫荧光标记发现 CRMP2对神经元表面GABA受体的表面表达是负性调节作用，而对AMPA受体的表达是正性的调控作用。体外的pulldown、coIP以及体内的荧光共定位实验证实了CRMP2与AMPA受体的GluA1亚单位存在直接的相互作用。进一步在构建的亚急性肝性脑病小鼠上明确了突触形态以及认知功能的损害，而抑制CRMP2T514位点的磷酸化可明显改善肝性脑病小鼠的认知功能。这些结果有望为肝性脑病相关的治疗和药物开发提供一定的实验证据。