突触蛋白Syntaxin在支气管哮喘肥大细胞脱颗粒过程中的作用及调控机制

肥大细胞(MC)是支气管哮喘慢性炎症发生发展过程中关键触发细胞和效应细胞，致敏的MC大量合成并以脱颗粒形式释放组胺等多种炎性介质致哮喘发作。但哮喘MC脱颗粒的机制尚不明了。突触蛋白Syntaxin(Syx)是神经内分泌-免疫炎性细胞囊泡导向、运动、锚定、融合后脱颗粒过程中最重要的调控因子。本课题组前期工作证实MC富表达Syx；在哮喘致敏MC中Syx表达量显著增加；尤其是在分泌囊泡（内含炎性介质）质膜上表达显著增强。由此我们推测Syx可能对哮喘MC分泌囊泡与胞膜融合导致脱颗粒过程起着关键性调控作用。在建立哮喘大鼠模型，分离、纯化和培养MC的基础上，采用siRNA干涉抑制或病毒载体细胞转染促进Syx表达，检测Syx异常表达对MC脱颗粒标志物组胺释放量的影响，从而判断Syx对哮喘MC脱颗粒调控作用，从分子水平上更深入地探讨哮喘的发病机制，期望在临床上寻找可能抑制或阻断哮喘MC释放炎性介质的途径。

本课题按照国家自然科学基金计划书要求较顺利地进行并完成相关内容，首次证实了前突触蛋白Syntaxin（Syx）参与调控哮喘肥大细胞（mast cell, MC）脱颗粒的分子生物学过程，为寻找可能阻断或抑制哮喘炎症反应的药物提供了新思路。相关实验结果表明，与正常组比较，Syx在哮喘致敏的MC中总表达量显著增加；而且，Syx在正常组MC以胞膜表达为主（t-SNARE蛋白），而在哮喘MC上Syx重新分布（再定位），其由胞膜转运到分泌囊泡质膜上，且质膜上的表达显著增加（v-SNARE蛋白）。Syx的表达受siRNAsyx及SFV-Syx融合蛋白的双向调节，进一步的研究表明抑制MC Syx的表达量可以减少组胺等炎性介质的最终释放量。因此，我们认为Syx由哮喘致敏的MC胞膜转移到分泌囊泡膜上是MC分泌囊泡导向、转运、锚定及最后与质膜融合是MC脱颗粒过程必要的前提条件。这一结果表明Syx在哮喘致敏的MC脱颗粒释放炎性介质的过程中可能起关键性调控作用。这首次证实了免疫炎性MC的释放过程符合神经-内分泌细胞胞吐发生机制与调节特点，初步证实我们先前提出的科学假设，是本课题取得的最大收获。通过本课题研究，我们还掌握了几个关键实验技术，在后续的研究和相关实验中会得以广泛应用，表现为：1.采用不连续Percoll密度梯度方法提取、分离、纯化MC技术；掌握其技术要领则提纯的纯化率可达到96%以上，足以满足免疫荧光细胞化学、基因和蛋白水平的半定量检测，方法简单价廉。2. 若加入3T3成纤维细胞悬液共培养则MC成活可达7-10天，较有关文献报道时间明显延长，这一技术有利于对肥大细胞的培育后处理和干预。3.在Syx的DNA基因序列功能区设计的短链寡核苷酸siRNA，通过反复浓度梯度和时间点的确定证实最终配制终浓度为40nM，且siRNAsyx与Lipofectamine 2000及MC共培养24-48小时，其siRNAsyx抑制效率最高，达90%以上。4.本实验研究获得了突触蛋白Syx参与调控哮喘MC脱颗粒的影像学和分子生物学证据，为进一步研究免疫炎性MC的释放过程提供了良好的基础。在本项目资助下课题组已完成相关论文3篇，其中SCI论文2篇；另有2篇SCI论文正在投稿中，是本项目的核心内容，将在线更新。