基于DNA介导蛋白邻近重构的核酸快速分析新方法

近年来随着高通量筛查与临床即时诊断的迅速发展，对核酸传感提出了兼具高灵敏与简便快速的新要求。针对这一要求，本项目拟将核酸-蛋白偶联技术与片段蛋白重组技术结合起来，提出DNA介导蛋白邻近重构（简称DPPR）的核酸检测新原理。该原理基于分子生物学技术制备报告蛋白（酶或荧光蛋白）片段，并将报告蛋白片段与DNA探针进行偶联，通过DNA探针或核酸适体等功能核酸探针的分子识别行为，介导蛋白片段发生邻近重组、功能恢复并产生信号。在此原理基础上，根据报告蛋白与酶底物分子的不同分别建立多种新型的可视、荧光及电化学传感技术，并发展具有DPPR特征的核酸放大新技术。该课题将核酸探针的强大生物识别功能、酶催化信号放大的高灵敏度、以及片段蛋白重组对于生物相互作用的高特异性、免分离、均相检测的特点相融合，以期建立起多种适合核酸快速检测的超敏分析新方法。

近年来随着高通量药物筛选和临床实时诊断技术的迅速发展，对于核酸及蛋白传感提出了兼具高灵敏与简便快速的新要求。针对这一需求，本课题拟发展片段蛋白互补技术与核酸-多肽偶联技术及相关生物传感方法，以期将两者进一步结合发展基于DNA介导蛋白重构的生物传感新原理。本课题完成了超折叠绿色荧光蛋白片段蛋白互补体系的构建，并基于此体系构建了蛋白激酶的无标记分析新方法。进一步在超折叠绿色荧光蛋白基础上进行分子改造，构建了超电荷荧光蛋白体系用于生物传感，发展了多种核酸修饰及蛋白翻译后修饰及相关酶的检测新方法。同时详细研究了DNA-多肽偶联物的制备条件及流程，通过点击化学偶联及巯基-氨基双偶联方法成功获得稳定且高产率的DNA-多肽偶联物。并利用DNA模板化Click偶联发展了多种生物传感新方法，还发展了多种核酸传感及可控自组装新方法用于多输入逻辑门构建及DNA-蛋白相互作用检测。进一步的DNA介导蛋白重构相关研究工作仍在进行当中。以上工作均具有高特异性及灵敏度，步骤简单快速、免分离、均相检测的等特点，将为建立具有快速检测特点的超敏生物分析新方法提供坚实基础。