基于微流控芯片的转移性乳腺癌CTCs的检测及其功能研究

Observing the level and the nature change of CTCs through collecting a fixed amount of the peripheral blood can be used for early diagnosis, monitoring the course of tumor development and judging the prognosis of patients, etc. CTC is an important clinical biomarker. Currently, CTCs researches mostly focused on the separation and detection technologies with limited concern on the physiological activity, phenotypic and molecular characteristics of CTCs. This project seeks to develop a microfluidic chip-based technology for CTCs efficient capture and controlled-release method. On the basis of good cell viability, biological characteristics of CTCs were analyzed in three-dimensional environment. Then, the true invasive and metastatic of CTCs characteristics were screened. Meanwhile, the cell phenotypic and molecular characteristics of CTCs were confirmed, which can provide important basis for the clinical diagnosis of tumor. Eventually, the appliance of CTCs as a target for in vitro experiments and analysis of clinical tumor diagnosis can be established, which can provide a more effective way for early diagnosis of tumor found.

通过采集固定量的外周血观察CTCs在血液中含量的高低和性质的改变，可用于肿瘤患者的早期诊断、发展过程监测、评估患者的预后等，是具有重要意义的临床生物标志物。目前CTCs研究大部分集中在对其分离及检测技术的发展，对分离、捕获后CTCs的生理活性、表型和分子特征关注有限。本项目力图发展一种基于微流控芯片技术的CTCs高效捕获及可控释放的方法，在保证细胞活性的前提下，对其生物学特征进行分析，筛选出真正具有侵袭能力和转移特性的CTCs，确认其表型及分子特征，为临床肿瘤诊断提供重要依据，最终建立适用于以CTCs为靶点进行临床肿瘤诊断与分析的体外实验平台，更有效的进行肿瘤早期诊断与发现。

通过采集固定量的外周血，观察CTCs在血液中含量的高低和性质的改变，可用于肿瘤患者的早期诊断、发展过程监测、评估患者的预后以及识别患者接受治疗后临床状况的改善情况等作出诊断，是具有重要意义的临床生物标志物。.本项目从临床基础研究的需要出发，设计了一种可用于CTCs高效捕获及释放的微流控芯片，利用生物素（biotin）与链霉亲和素（streptavidin）结合系统将一段DNA片段修饰在芯片通道内部，再结合上上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）抗体，使得抗体完全暴露在芯片的液流区，通过这个伸出去的触手“DNA片段”，来实现高效捕获表面表达EpCAM的肿瘤细胞。芯片优化后，CTCs的捕获效率为80.8±4.7%，明显优于流式细胞仪标记效率67.3±2.0%。通过DNase内切酶的作用可使已经被捕获的细胞无损释放，通过Calcein-AM 和PI双染，得出回收后的细胞活性大于95%。.在保证细胞活性的前提下，为了最大程度地模拟CTCs在人体内所处的微环境，课题组在体外构建了可用于三维肿瘤细胞转移研究的微芯片，能够有效的筛选出真正具有侵袭能力和转移特性的CTCs，确认其表型及分子特征，为临床肿瘤诊断提供重要依据。我们通过病毒转染的方法获得了CD-82过表达的MDA-MB-231细胞株，通过对比野生型MDA-MB-231细胞株，反映出了两种细胞随着时间推移，侵袭面积都在逐渐增加，但野生型细胞的侵袭面积大于CD82过表达的细胞，通过免疫荧光染色，发现介导wnt通路的核心蛋白β-catenin发生了从细胞核到细胞膜的明显转移；而QPCR和免疫印迹技术分析结果显示：在乳腺癌细胞中CD82可能是通过wnt/β-catenin通路中的两种途径抑制了细胞侵袭：1）.下调FZD，使WNT蛋白无法与一定数量的FZD结合；2）.下调CK1α，加速β-catenin在细胞质中的积累。研究揭示出CD-82在转移性乳腺癌侵袭过程中的重要作用。.我们设计的不同高度的微流控芯片也可以用于其他生物学分析。比如，对芯片稍作修改，我们便构建了接近生理条件下的骨重建微环境，可以实现滑膜细胞、成骨细胞，破骨细胞的共培养，并可以进行药效评价。