IL-35通过促进肾脏巨噬细胞M2型极化保护脓毒症性急性肾损伤的作用研究

Acute kidney injury (AKI) is a common serious complication of sepsis and there is a lack of effective treatments. Macrophage-mediated immune inflammatory responses participate in the development of AKI. Our previous study found that renal tubular epithelial cells express the immunosuppressive factor IL-35, and IL-35 may play a protective role in sepsis AKI, but the specific mechanism is unclear. We first constructed a mouse model of sepsis AKI and clarified the relationship between IL-35 expression and apoptosis of renal tubular epithelial cells and AKI. Subsequently, mice were injected with recombinant IL-35/IL-35 to construct a sepsis AKI model, and renal tubular epithelial cells transfected with IL-35 interfering/overexpressing lentiviral vectors were co-cultured with macrophages, followed by LPS. Stimulation, to explore the relationship between IL-35 level changes, macrophage M1/M2 differentiation, and renal tubular epithelial cell apoptosis. Finally, in vitro and in vivo experiments, after observing the JAK1-STAT6 signaling pathway, we observed the changes of the above-mentioned three, and defined that IL-35 regulates the macrophage M2 polarization, which in turn affects the renal tubular epithelial cell apoptosis and sepsis AKI specific mechanism. This study provides a theoretical basis for IL-35 as a new therapeutic target for sepsis AKI.

急性肾损伤（AKI）是脓毒症常见的严重并发症，缺乏有效治疗方法。巨噬细胞介导的免疫炎症反应参与AKI的发生发展。我们前期研究发现肾小管上皮细胞能表达免疫抑制因子IL-35，并且IL-35可能在脓毒症AKI中起保护作用，但具体机制不清。我们首先构建脓毒症AKI小鼠模型，明确IL-35表达与肾小管上皮细胞凋亡及AKI之间的关系。随后使用重组IL-35/IL-35抗体注射小鼠构建脓毒症AKI模型，使用转染IL-35干扰/过表达慢病毒载体的肾小管上皮细胞与巨噬细胞进行共培养，再给予LPS刺激，探讨IL-35水平变化、巨噬细胞M1/M2分化以及肾小管上皮细胞凋亡之间的关系。最后在体内体外实验中，干预JAK1-STAT6信号通路后观察上述三者的变化，明确IL-35调节巨噬细胞M2型极化，进而影响肾小管上皮细胞凋亡和脓毒症性AKI的具体机制。本研究为IL-35作为脓毒症性AKI新的治疗靶点提供理论依据。

急性肾损伤（AKI）是脓毒症常见的严重并发症，缺乏有效治疗方法。巨噬细胞介导的免疫炎症反应参与AKI的发生发展。我们拟通过体内体外实验，阐明IL-35通过诱导巨噬细胞M1/M2分化参与肾小管上皮细胞凋亡，影响脓毒症AKI；阐明炎症因子IL-35对脓毒症AKI起保护作用。.实验结果表明：1、脓毒症AKI时，小鼠肾脏病理改变显示肾小管上皮细胞较多细胞为TUNEL阳性染色，生化检测AKI时常伴有肝功能ALT、AST明显升高。并且脓毒症后小鼠死亡率越高时，AKI的发生率也越高，脓毒症AKI发生率与死亡率呈显著负相关。2、免疫组化法和免疫荧光法检测发现，脓毒症AKI组和对照组肾脏中IL-35均在肾小管上皮细胞表达，但肾小球和肾小血管中未见表达，脓毒症AKI组IL-35水平较对照组明显降低。肾脏局部IL-35蛋白水平与血清Cr、ALT、AST水平呈显著相关性，而与血清BUN水平无相关性。3、LPS刺激HKC后IL-35的基因和蛋白表达在LPS刺激后4h、8h明显升高，随后逐步下降。IL-35的基因和蛋白表达的变化趋势与细胞凋亡率负相关。4、LPS刺激HKC细胞24小时后，与对照组比较rIL-35组、对照siRNA组、IL-35siRNA组上清LDH水平均明显升高。HKC＋LPS组、rIL-35组、对照siRNA组的细胞凋亡率没有明显差异，但是IL-35siRNA组较其他各组，细胞上清LDH水平明显升高，细胞凋亡率明显升高。5、NanoString GeoMx DSP数字式空间多靶标分析系统检测原位切片20个蛋白。与对照组比较，CD11、CD45、F4/80的差异表达倍数以及表达水平在AKI组有明显升高，CD4和CD19的差异表达倍数以及表达水平在AKI组也有明显升高。但在AKI组内，CD11、CD45、F4/80的表达水平较CD4和CD19的表达水平明显升高。表明在AKI组肾脏局部激活的单核细胞明显增多，B淋巴细胞和T淋巴细胞较少。6、IL-35刺激单核细胞后，与PBS阴性对照组、加IL-35抗体对照组比较，上皮细胞培养上清加到单核细胞组和外源性IL-35阳性对照组，M2 巨噬细胞的标志物CD163 和 CD206 的 mRNA 表达明显升高，M1 巨噬细胞的标志物iNOS的 mRNA 表达无明显变化。表明IL-35刺激单核细胞后，单核细胞向M2巨噬细胞转化。