人博卡病毒体内外培养体系的构建

人博卡病毒(human bocavirus , HBoV) 是细小病毒科的一个新成员。HBoV的易感人群多为婴幼儿急性呼吸道感染的病例，其感染多发生在秋冬季节。HBoV的感染可以单独存在，也可以和其他病毒混合感染。主要临床表现为咳嗽、流涕、气喘、呼吸困难和发热，以高热为主，阵发性咳嗽较为突出。本项目立足于和博卡病毒同科的其他病毒的培养经验，尝试探索人博卡病毒的培养方法，并进一步构建出稳定可行的动物模型。采用已建立的荧光定量PCR的方法来进行成果验证,从而为博卡病毒的深入研究提供实验基础。

人博卡病毒(human bocavirus 1, HBoV) 是从婴幼儿的呼吸道感染样本中检测到的一种新的细小病毒，是继细小病毒B19后发现与人类疾病有关的细小病毒成员。人博卡病毒成员包括：HBoV1-HBoV4。HBoV1的易感人群多为婴幼儿急性呼吸道感染的病例，在呼吸道分泌物中HBoV1的检出率为1.5%-24.6%。HBoV1可单独感染，也可以与其他病毒混合感染；其感染的临床症状主要表现为咳嗽、发热并伴有哮喘。本项目采用TaqMan探针实时定量PCR方法（TaqMan PCR）和微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）的方法检测湖北武汉地区儿科住院病例的鼻咽分泌物中HBoV1的感染，并尝试探索人博卡病毒的体内外培养方法及致病机制，为人博卡病毒的深入研究提供实验基础。通过所建立的TaqMan PCR方法对收集到的214例住院患儿的咽拭子标本进行检测，结果显示HBoV1感染的阳性率为3.74%。采用ddPCR方法检测182例住院患儿咽拭子标本，结果显示ddPCR方法检测到HBoV1定量限低至0.5copies/μl，HBoV1感染的阳性率为8.24%；使用TaqMan PCR方法检验，阳性率为3.30%。选取HBoV1绝对定量高的阳性样本制备病毒除菌液，感染多种细胞系及胶质瘤细胞系，在试验细胞中未出现相关变化；将含有中间大片段(缺少ITR)的HBoV1基因组克隆WHL-1转染胶质瘤细胞系，未检测到HBoV1 DNA的复制；将HBoV1病毒除菌液制备成气溶胶感染小鼠，无相关感染现象出现。本研究表明采用TaqMan PCR和ddPCR方法检测住院患儿鼻咽分泌物中HBoV1的感染率分别为3.74%和8.24%，微滴式数字PCR（ddPCR）对鼻咽分泌物中HBoV1的检测限、准确性和重复性更有优势，且不受样品基质和扩展效率的影响；胶质瘤细胞系非人博卡病毒的敏感细胞系；人博卡病毒分子两端的ITR序列对病毒侵染细胞发挥重要功能；制备人博卡病毒的感染性克隆对研究其生物学特性和致病分子机制有重大作用。