小麦TaCNGC-2A基因调控种子休眠持续期的功能解析

Wheat pre-harvest sprouting (PHS) occurred frequently in a long period of rainfall or high humidity during harvest, seriously affecting grain quality and yield. Growing cultivars with long-duration seed dormancy is the most effective solution to reduce PHS damage. Previously, we identified a new major QTL for long-duration seed dormancy on chromosome 2AL in white-grained landrace wheat "Suiningtuotuomai", and narrowed the locus within the physical interval of 464.6 kb using a secondary segregating population. A candidate gene designated TaCNGC-2A, encoding cyclic nucleotide-gated channel (CNGC) protein, was cloned, which has not been reported in wheat yet. Association and linkage analysis as well as RT-PCR indicated that TaCNGC-2A was significantly associated with long-duration seed dormancy. In this project, we will unravel how this gene controls seed dormancy duration in physiological-biochemical and transcriptional levels, and confirm the function of TaCNGC-2A using both gene over-expression and RNAi approaches. Furthermore, the interaction between CNGC and calmodulin (CML15) will be verified using both yeast two-hybrid and bimolecular fluorescence complementation techniques, and haplotype analysis will be performed in about 1000 wheat germplasm collected from different countries. These results will further uncover the regulatory network of TaCNGC-2A involved in seed dormancy, and provide valuable knowledge, molecular markers and specific germplasm for improvement of PHS resistance in wheat breeding.

小麦收获期遭遇持续阴雨天气极易穗发芽，严重影响产量和品质。种植种子休眠持续期长的品种是解决穗发芽问题的根本途径。我们前期在地方品种遂宁坨坨麦中发现一个种子休眠持续期新主效QTL（2AL），利用次级群体将其缩短到464.6kb区间，并克隆候选基因TaCNGC-2A（编码环核苷酸门控通道蛋白）；连锁和关联分析及RT-PCR均显示该基因与种子休眠持续期紧密相关，小麦中尚未报道。本项目拟选择10份携带不同等位变异且休眠持续期差异显著的品种，从生理生化和转录水平验证TaCNGC-2A与种子休眠持续期的关系；利用过表达和RNAi手段证实该基因功能；利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证CNGC与钙调蛋白的互作关系；利用基因功能标记分析来自世界多个国家1000余份小麦种质资源的单倍型，并筛选种子休眠持续期长的种质。研究结果将提高对小麦种子休眠分子基础的认识，为培育抗穗发芽品种提供基因、标记和特异种质。

小麦在收获前如果遭遇降雨或湿热天气容易发生穗发芽。小麦穗发芽一般减产6-10%，严重者，则降级为饲料麦。全球小麦每年由于穗发芽造成的损失高达10亿美元。种子休眠是穗发芽抗性的主要遗传因素。因此，挖掘种子休眠关键基因，阐明其调控机制，挖掘其优良等位变异，对减轻小麦穗发芽灾害尤为重要。. 前期，申请人在小麦地方品种中鉴定出一个位于2AL染色体控制种子休眠的主效QTL（Qsd.ahau-2AL），并利用连锁群体和关联群体进行了验证。本项目基于多组学数据开发了多种分子标记，并构建了目标区段的高密度遗传连锁图谱，最终将目标位点缩短在0.47Mb区间（包含8个基因）。通过双亲转录组以及qRT-PCR分析，发现目标区间内仅有一个编码环核苷酸门控离子通道蛋白的基因（TaCNGC-2A）差异表达。TaCNGC-2A基因在两个亲本间共存在14处序列变异，其中针对1处位于启动子区域且造成缺氧诱导顺式作用元件改变的SNP进行了CAPS标记开发，并利用连锁和自然群体共同验证了其与种子休眠显著相关。QTL分析发现该基因与Qsd.ahau-2AL共分离，很可能是目标区段的候选基因。利用小麦、拟南芥、水稻突变体或过表达材料等共同验证了TaCNGC-2A负调控种子休眠。通过多种手段鉴定出其互作蛋白TaCaM-3A，并利用小麦和拟南芥突变体初步验证了TaCaM-3A与TaCNGC-2A具有相似的功能。结合转录和生理生化水平分析，发现TaCaM-3A与TaCNGC-2A通过影响GA和ABA合成/代谢/信号转导途径关键基因的表达进而调控种子休眠。此外，频率分布分析发现携带强休眠等位变异类型的品种在国内外种质中占比较低，且其主要分布在我国地方品种中，同时进一步分析了TaCNGC-2A不同等位变异与其他已知休眠基因组合对种子休眠的效应。研究结果为小麦抗穗发芽分子设计育种提供了重要科学支撑。