钙磷基纳米粒子的分布降解及其成骨系细胞响应机制研究

纳米羟基磷灰石（Nanom-Hydroxyapatite,NanoHAP）在骨科领域有广泛的应用前景，针对NanoHAP粒子引起成骨系细胞的生物响应机制及生物安全性还缺乏充足科学证据的现状，本申请项目提出假说："NanoHAP粒子对细胞是产生成骨效应还是毒性，取决于其在胞内降解释放钙离子的量及细胞调控胞内钙离子的能力"。为验证这一假说，申请项目采用41Ca－AMS痕量测定、量子点示踪、酶免、细胞及分子生物学等先进技术，研究在NanoHAP粒子作用下，成骨系细胞的黏附、增殖、分化等生物学行为及功能表达的变化与细胞内钙离子浓度的关系，并通过观测对胞内钙稳态维持有重要作用的钙调蛋白及钙依赖ATP酶的表达变化，探讨细胞调控胞内钙离子的能力是否左右这一生物响应的进程与归宿-成骨抑或毒性，进一步揭示钙磷基纳米材料与骨的相互作用机理，对骨科临床评价纳米材料类骨植入物的功效及安全性有重要意义。

纳米羟基磷灰石（NanoHAP）在骨科有广泛的应用前景，但NanoHAP引起成骨系细胞的生物响应机制及生物安全性还证据有限。本项目制备了纳米级HAP、41Ca-HAP粒子及其稳定分散体系；研究了NanoHAP粒子在成骨系细胞MC3T3E1内的分布；探讨了NanoHAP对 MC3T3E1的增殖、凋亡影响；重点研究了NanoHAP对MC3T3E1细胞内钙离子波动的影响，及其对具有胞内钙离子浓度自稳调节作用的钙调蛋白及激酶表达的影响；着重探讨了NanoHAP调节MC3T3E1骨向分化的基因表达；考察了NanoHAP骨植入后在重要器官的分布。 结果显示：（1）制备的NanoHAP呈长轴30nm和短轴8nm的棒状，加分散剂后在细胞培养体系中分散稳定；（2）团聚态的NanoHAP在MC3T3E1中以“大吞噬泡”状态存在并对细胞造成挤压，而分散后的NanoHAP则以“小液泡”状态存于胞内；（3）NanoHAP浓度100μg/ml以下对MC3T3E1增殖影响轻微，而200μg/ml可显著抑制细胞增殖；浓度50 μg/ml 以下的NanoHAP对MC3T3E1凋亡影响不显著，而超过100μg/ml 时细胞凋亡逐渐增加；（4）12.5、25、50、100、200μg/ml浓度的NanoHAP在 4个共培养时间点（1h、3h、6h、12h）都引起MC3T3E1内Ca2+浓度显著增加，其中200 μg/ml组在6 h时引起细胞内Ca2+浓度增加20倍；随NanoHAP浓度增加，共培养7天CaM和CaMKⅡα表达也逐步上调；（5）随着NanoHAP浓度升高（12.5、25、50、100μg/ml ），共培养7天MC3T3E1成骨分化基因ALP、BMP2、BSP、 COLⅠ 、OSC、Runx2表达皆逐渐增强；(6)对纳米材料骨注射后不同时间的重要器官组织特异染色、电镜扫描及钙离子检测未见NanoHAP粒子。上述关于NanoHAP作用浓度增加引起MC3T3E1胞内钙离子浓度逐步升高并引起CaM和CaMKⅡα的表达也上调的发现性结果、NanoHAP对MC3T3E1骨向分化的促进作用具有浓度依赖性、以及高浓度NanoHAP 抑制细胞增殖和促使细胞凋亡等结果验证了本项目的科学假设。为进一步研究NanoHAP与骨再生的关系机制提供了实验依据，对探索纳米HAP的骨诱导性具有重要的理论意义和临床应用价值。