灯盏乙素对抗β淀粉样蛋白神经毒性作用的靶标定位及分子机制研究

Nowadays, the drugs available for the treatment of Alzheimer's disease(AD) are not well effective. In the previous researchs we haved observed the curative effect of Scutellarin (Scu), a major active principle extracted from HE, on the cholinergic function, oxidative stress, inflammation and apoptosis aim to AD. β-amyloid peptide(Aβ) neurotoxicity plays an important initial and pivotal role in the disease. Therefore, putting it as the target, molecular mechanism of neurotoxicity and pharmacal targets of Scu against Aβ are penetrating investigated in this study. The study at present is to screen targeted proteins and Aβ toxicity signaling pathways for the medicine treatment, to detect expression of Aβ、total APP、secretion type APPα、BACE1 and BACE2, and to observe depressive effect of Scu in the course of Aβ production by using APP transgenic animal model, AD animal model by injecting Aβ and cells models dependant on Aβ. These advance methods concerning iTRAQ, pathway analysis technique, Western blotting, real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction and Co-immunoprecipitation will be employed in this study. The obtaining results in this study will further reveal direct molecular mechanism and effective approach of Scu against AD, and will provide valuable evidence for the clinical application of Scu (as a anti-dementia drug).

目前对阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）尚无特效治疗方法，我们前期的研究观察到灯盏细辛活性成分灯盏乙素在胆碱能系统、氧化应激及凋亡方面对AD有干预作用。β淀粉样蛋白（β-amyloid peptide, Aβ）是AD的始发因素和神经毒性中心环节，本项目以此为靶点，深入研究灯盏乙素对抗Aβ的神经毒性机制和药物靶点分子机制。研究中采用APP转基因和脑室注射Aβ的动物模型和Aβ处理的细胞模型，利用蛋白定量技术（iTRAQ）及通路分析技术筛选药物治疗的靶标蛋白和调控Aβ的相关信号通路，运用蛋白印迹、实时荧光定量聚合酶链反应、免疫共沉淀等先进方法，测定Aβ、总APP、分泌型APPα、BACE1、BACE2等的表达，观察灯盏乙素对Aβ生成的抑制作用。本研究结果将进一步揭示灯盏乙素干预AD发生发展的作用途径和分子机制，为其作为应用于临床的抗痴呆药物提供理论依据和临床研究支撑。

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）目前尚无特效治疗方法。β淀粉样蛋白（β-amyloid peptide, Aβ）无论是疾病的起因还是结果，其神经毒性作用被认为是公认的中心环节，找寻对抗Aβ毒性所致的学习记忆能力损害的药物，在AD治疗中具有积极的现实意义。本课题以淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）swe／PS△E9双转基因和侧脑室注射Aβ的动物模型为载体，利用同位素标记相对和绝对定量及生物信息学通路分析技术筛选出中药灯盏细辛有效活性成分灯盏乙素（Scutellarin, Scu）治疗的 Aβ毒性差异蛋白和调控的信号通路，在此基础上针对依赖于Aβ的细胞模型，佐以Morris水迷宫、蛋白印迹、实时荧光定量聚合酶链、激光扫描共聚焦显微镜、流式细胞分析、免疫组织化学、生物化学等蛋白组学、病理学与分子生物学经典的实验技术和方法的运用，找寻到Scu对抗Aβ神经毒性作用的靶标蛋白，并进行基于靶标蛋白的Scu抗Aβ毒性分子机制研究。结果显示：1、Scu能够改善两种Aβ毒性痴呆模型小鼠下降的学习记忆能力；2、Scu能够调节类痴呆动物脑组织及神经元细胞中Aβ生成途径主要因子APP、β位点APP切割酶1和2的表达，通过干预APP代谢的β分泌酶途径来抑制Aβ的生成；3、发现Scu主要调节了Aβ源性痴呆模型小鼠脑组织中两类差异蛋白的表达，一类是组蛋白（H2A 、H2B 、H3），另一类是钙稳态相关蛋白（IP3R、KATP、ANT），推测Scu可能通过对组蛋白修饰方面的表观遗传信息改变和钙稳态平衡的影响来减少Aβ沉积，改善Aβ毒性所致的学习记忆能力损害；4、进行基于靶标蛋白的Scu抗Aβ毒性分子机制研究，发现Scu能够调节Aβ所致的动物脑组织和SH-SY5Y细胞中组蛋白H2A、H2B、H3的表达异常；能够介入IP3R-Ca2+途径抑制神经细胞凋亡；能够调节ANT2参与拮抗Aβ所致的神经元线粒体损伤；能够调节ATP敏感内流型钾通道抑制神经元损伤。本研究获取了Scu抗痴呆方面的蛋白质重要信息，在一定程度上阐释了药物的疗效基础和分子作用机理，获得中药治疗AD作用机制上的新信息，扩展了Scu在AD治疗方面的药用范围，为其下一步的临床应用提供了可靠的实验资料和理论依据。