葡萄βVPE基因的多态性与无核性状形成的关系研究

生产中无核葡萄是由正常授粉受精的胚珠在发育过程中败育解体而形成的。液泡加工酶（VPE）是植物内启动和执行细胞程序性死亡的关键基因，β型VPE是种子特异表达和发育所必须的基因。本项目在已克隆葡萄βVPE基因7个转录本基础之上，分析有核和不同败育程度无核葡萄βVPE基因转录本，测定各转录本的基因表达量和不同时期葡萄胚珠中VPE酶活性，确定βVPE基因各转录本对VPE酶活性的影响；进一步将具有翻译活性的转录本转入T-DNA插入的拟南芥βVPE基因完全敲除突变体中进行功能互补，测定回复突变体种子VPE酶活性，对比各转录本超表达拟南芥突变体、同源基因完全敲除突变体、回复突变体和野生型的表现型差异，综合分析各转录本的VPE酶活性和生物学功能，进一步阐明葡萄βVPE基因不同转录本与种子发育的关系，为揭示无核葡萄形成机理提供基础。

葡萄无核在正常授粉受精后胚珠发育途中发生细胞程序性死亡而形成的。液泡加工酶（VPE）是植物体内启动和执行细胞程序性死亡的关键基因。本项目克隆葡萄VPE和metacaspase的基因，分析表达差异，研究启动子功能，鉴定βVPE生物学功能。主要研究结果如下：.①克隆VPE基因3个成员，通过真核表达体系分析其具有VPE酶活性。βVPE在根部、花、芽和胚珠中表达，βVPE在有核和无核品种胚珠发育的后期的表达差异明显；γVPE在各组织中都有表达，而δVPE则只在花、芽和胚珠中表达。.②克隆了19个品种βVPE基因cDNA和6个gDNA序列。在转录水平研究表明βVPE为胚珠特异表达，在有核品种的表达量随着胚珠发育逐渐增大，而在无核品种一直处在较低的表达水平。在翻译水平研究表明在有核葡萄胚珠发育的10d-20d、25d-40d和45d-70d，βVPE基因分别以前体（pβVPE）、中间体（iβVPE）和成熟体（mβVPE）的形式表达，而在无核葡萄各时期均以pβVPE形式存在。研究表明有核葡萄中具有活性的mβVPE在葡萄种子成熟过程中起着加工其他蛋白前体的作用，无核品种缺乏有活性的mβVPE可能是导致无核的原因之一。.③转葡萄βVPE基因的拟南芥种子VPE酶活性提高，而VPE四突缺失型几乎检测不到酶活性；种子发芽试验表明转βVPE基因明显加快了拟南芥种子的萌发速度，推断葡萄βVPE基因可能参与葡萄种子萌发过程。.④克隆了12个不同败育程度葡萄品种的βVPE基因启动子，构建了启动子与GUS报融合表达载体，转化拟南芥。GUS染色表明葡萄βVPE基因启动子为种子特异启动子；无核白与黑比诺的启动子活性无明显差异，表明βVPE基因在黑比诺与无核白中的表达差异可能还与其他调控基因表达的影响因子有关。对无核白βVPE基因启动子进行功能缺失分析，表明片段(-1302~-1041 bp)中可能存在与种子特异表达相关的作用元件或相关序列，并确定下调和上调启动子表达活性区段。.⑤克隆了葡萄metacaspase基因6个，定量分析表明部分基因存在组织特异性；在无核白葡萄胚珠大量败育期VvMC1、VvMC3和VvMC4表达显著上调，参与无核白葡萄胚珠败育。.另外，克隆了SVP类MADS-box 、VvTIAR-like和VvWRKY20基因，均在有核和无核胚珠发育中表现不同的表达模式，与无核葡萄胚珠败育相关