Survivin基因表达及其34位点磷酸化双重干扰对鼻咽癌细胞增殖、凋亡及放疗敏感性的影响

近期研究发现Survivin与鼻咽癌细胞增殖、抗细胞凋亡密切相关，而Survivin 34位点磷酸化状态与Survivin蛋白稳定性及放疗抵抗相关，此位点的磷酸化由CDK1 激酶催化完成。本研究拟构建pU6-shRNA-Survivin重组质粒及pU6-shRNA-Survivin-CDK1重组质粒，并对鼻咽癌细胞株 CNE-2进行体内、体外RNA干扰，以了解双重干扰Survivin基因表达及34位点磷酸化对CNE-2鼻咽癌细胞增殖、凋亡和对放疗敏感性的影响，旨在筛选具有强干扰作用的pU6-shRNA-Survivin-CDK1的重组质粒，深入探讨鼻咽癌靶向基因治疗的可行性。

本研究设计了干扰Survivin基因及CDK1基因的shRNA序列，成功构建shRNA-Survivin重组质粒、shRNA-CDK1重组质粒及pU6-shRNA-Survivin-U6 -shRNA-CDK1串联重组质粒，并分别转入CNE-2细胞株，然后检测细胞生长状况、shRNA-Survivin和shRNA-CDK1对相应的基因表达水平的抑制及对细胞成瘤性的影响。应用噻唑蓝（MTT）法检测shRNA对细胞生长增殖的抑制作用；RT-PCR法检测shRNA对Survivin基因及CDK-1基因转录的抑制作用；流式细胞术检测shRNA诱导细胞凋亡作用；Western blot法检测Survivin蛋白及CDK-1蛋白表达效果；然后建立荷瘤小鼠模型，比较分析重组质粒RNA干扰对荷瘤小鼠的成瘤性、放疗敏感性影响的差异。结果显示：shRNA的表达对细胞生长抑制率分别为26.0%、15.6%及32.5%； shRNA的表达对Survivin基因及CDK-1基因转录的干扰效率分别达82.4%及85.0%； shRNA的表达有诱导细胞凋亡作用，凋亡细胞数分别为5.4%、4.7%及15.2%；shRNA-Survivin、shRNA-CDK1 下调Survivin蛋白和CDK1蛋白的表达，而串联质粒组同时下调Survivin、CDK1蛋白。裸鼠荷瘤实验对照组成瘤率达100%，shRNA重组质粒转染组能够干扰荷瘤小鼠的肿瘤生长、使肿瘤生长减慢；放疗后肿瘤有所缩小，实验组比对照组肿瘤明显缩小，尤其是串联组肿瘤缩小更加明显；裸鼠处死后病理切片染色观察证实生长的肿块为肿瘤组织。体外和体内shRNA干扰能够诱导基因沉默，致使致病基因失去功能，为将来鼻咽癌基因治疗提供了实验数据。