Dicer/miRNA-210在肝癌血管生成中的作用及其机制研究

Tumor angiogenesis, which is a procedure of new blood vessel formation within tumor tissues, is crucial for tumor growth, recurrence and metastasis. The mechanisms of tumor angiogenesis however remain unclear. Upon our experimental observation we were the first to discover that Dicer, a key enzyme for miRNAs biosynthesis, is associated with tube formation of endothelial cells in vitro. During this procedure miRNA-210 plays an important role through targeting angiogenic inhibitor Ephrin-A3. But, the roles of Dicer/miRNA-210 in tumor endothelium are unknown. In this proposal, to elucidate roles of Dicer/miRNA-210 pathway in tumor angiogenesis, we first isolate the tumor endothelial cells, by a flow cytometry sorter, from the primary hepatocellular carcinoma; then we detect the expression of the genes and proteins of interest in tumor endothelial cells by PCR, Western Blot and Immunofluorescence, and identify target mRNAs of miRNA-210. Finally, we use lose-of -function (gene silence by siRNA) or gain-of-function (over- expression by gene transfection) methods to functionally validate Dicer/miRNA-210 roles and analyse the changes of endothelial cell behaviors in vivo and in vitro. This study would provide further insight into mechanisms of tumor angiogenesis, and open up for development of anti-angiogenic cancer therapies.

肿瘤血管生成是肿瘤发展、复发和转移的必要基础，但其调控机制尚未完全清楚。我们前期的研究首次表明：Dicer通过影响miRNA-210作用靶向血管因子Ephrin-A3，引起血管内皮细胞功能改变。然而,此通路在肿瘤血管生成中的作用和机制仍有待于研究。本项目拟以原发性肝癌血管内皮细胞为研究对象，采用流式细胞仪分选肝癌血管内皮细胞，结合基因和蛋白表达技术，分析Dicer、miRNA-210在肝癌血管内皮细胞中的表达，筛选和鉴定与其密切相关的靶标基因；用表达下调或过表达的方法，在体内外实验验证Dicer/miRNA-210及其相关分子对肝癌血管内皮细胞功能的作用，揭示Dicer/miRNA-210在肝癌血管生成中的调控通路。本研究必将为阐明肿瘤新生血管的发生及其调控机制提供科学依据，为确立肿瘤血管特异性的分子靶点以及肿瘤血管靶向药物的研发提供坚实的理论基础。

肿瘤血管生成是肿瘤发展、复发和转移的必要基础，但其调控机制尚未完全清楚。既往的相关研究由于局限于非人源性肿瘤血管内皮细胞，导致实验数据不能直接反映肿瘤血管生成的问题。因此，本项目从研究的源头（实验材料的制备）到功能调节机制（信号通路），系统性地探讨了Dicer和miRNA-210在肝癌血管内皮细胞中的调节作用及其机制。本课题组收集了59例临床原发性肝癌手术标本，采用免疫磁珠和流式细胞仪双分选方法，提取的肝癌血管内皮细胞已通过形态学、内皮特异性标志物、生物学行为等检测和鉴定，成功地建立了原代肝癌血管内皮细胞模型。由于临床肿瘤标本资源匮乏，原代培养细胞传代次数有限等因素，使相关研究难以持续性地进行。为了解决这些局限性，本课题组利用临床肝癌手术标本成功地制备了一株永生化肝癌肿瘤血管内皮细胞系（ECDHCC-1）, 并申请了国家发明专利。这个细胞系的获得克服了对临床肿瘤标本的依赖性，使项目研究的持续性成为可能，并为肿瘤血管生成机制研究的实验和靶向药物的筛选研究提供了直接的细胞材料。本课题组采用ECDHCC-1研究了Dicer和miRNA-210在肝癌血管内皮细胞中的作用及其机制。结果表明：Dicer通过成熟miR-210作用于肿瘤血管内皮细胞，促进内皮细胞的管腔形成和迁移；经过筛选和鉴定，确认了2个miR-210的靶标基因RasL10B和FGFR5，并分析及确立RasL10B通过激活ERK通路来抑制肝癌血管内皮细胞的增生，而FGFR5通过激活P38通路来抑制肝癌血管内皮的迁移，从而抑制细胞的管腔形成和迁移能力的功能。所有体外生物学实验结果均通过动物体内实验进一步验证。本项目通过构建人源肝癌血管内皮细胞系，顺利完成Dicer/miRNA-210在肝癌血管生成中的作用及其机制研究的课题目标，同时产生了原创性论文及手稿8篇，发明专利申请1项，主办国际国内肿瘤学术交流大会2次，培养研究生数名，以发言和壁报参加国际国内学术交流会多次。