中国水仙花色形成功能基因的克隆分析与鉴定

中国水仙花色形成机制复杂，相关育种基础研究少，品种匮乏、花色单一。本项目拟以两色花、白花突变体和黄花突变体三种不同花色类型为材料，构建花朵cDNA文库以及副冠和花瓣特异性消减文库，通过EST测序，分离与水仙花色（黄色）形成相关候选调控基因全长，利用分子杂交分析其基因剂量与时空表达特异性；实时荧光定量PCR分析调控基因和花色合成酶基因的表达水平与花色形成三者间的动态关系；分离关键花色合成酶基因全长及其启动子，生物信息学分析在不同花色类型中是否发生变异；通过花色合成酶基因启动子驱动的GUS基因和调控基因在白花类型的副冠和花瓣的瞬时表达，进行互作基因间的功能鉴定。为进一步阐明中国水仙花色形成机制和构建其功能基因网络奠定基础。本项目是课题组20多年来从事中国水仙遗传背景及育种基础研究的延续和深化，对推动中国水仙基础理论研究和育种实践具有重要意义。

中国水仙是中国著名的十大名花之一，但由于主栽品种少，限制了水仙产业的发展。福建农林大学园艺学院搜集保存的白花水仙、黄花水仙和两色花水仙资源，是水仙花色形成机制研究的好材料。本项目以3种不同花色类型水仙为材料，构建花朵cDNA和SSH文库，分离水仙花色形成相关基因并进行功能鉴定，为进一步阐明中国水仙花色形成机制和构建其功能基因网络奠定基础。.主要研究结果如下：.1. 测定了3种不同花色水仙花被和副冠中类黄酮和类胡萝卜素的组成与含量。金盏银台的类黄酮物质主要是芦丁和柚皮苷，黄花水仙以芦丁为主；类胡萝卜素物质主要是叶黄素和β-胡萝卜素，黄花水仙两者含量都最高，白花最低。经T测验同一品种不同部位中叶黄素的含量差异显著，但芦丁差异不显著，推断水仙黄色和叶黄素有直接关系。.2. 构建了‘黄花水仙’盛开期花朵的全长cDNA文库，文库滴度为6.3×105 cfu/mL，重组率为84%，插入片段大小集中在500-2000bp，比较完整。.3. 构建了水仙花色差异表达消减文库；随机挑选正、反向消减杂交文库各750个阳性克隆进行测序，结果表明水仙花色形成涉及大量基因参与，是多个复杂代谢途径相互协作的结果；筛选获得PSY、F3′H、FOMT、ACO、CRTISO、IPI、HMGS、NCED、WRKY和WD 等10个与水仙花色形成、调控相关的uniESTs，并克隆了6个基因的cDNA全长序列。.4. 克隆了类胡萝卜素生物合成途径中PSY、PDS、ZDS、LCY-β和LCY-ε的全长cDNA序列和基因组DNA序列；比较了不同花色同一个基因的氨基酸和DNA序列，发现个别位置有差异，PSY、ZDS基因部分内含子区段缺失。分析了5基因在花色形成中的转录情况，发现金盏银台与黄花水仙中表达量较高，白花水仙中表达量极低，尤其PSY基因几乎不表达，说明这些基因的表达与水仙黄花色的形成密切相关。.5. 克隆了类黄酮生物合成途径中的CHS、CHI、F3H、F3′H、DFR、FLS。荧光定量分析表明CHS、CHI和F3H 三个基因在水仙花发育过程中的表达趋势基本一致，花发育早期表达量较高，随着发育进程表达量逐渐降低。.6. 构建了水仙再生体系，诱导小鳞茎的培养基为MS+5 mg/LBA+0.4 mg/L 2,4-D，生根培养基为MS+0.5 mg/LNAA，为转基因花色育种搭建了平台。