基于陆海渐渗系的棉花黄萎病成株抗性相关基因的鉴定与功能解析

Because the upland cotton lacks effective resistant resources of verticillium wilt, Verticillium wilt has become one of the major factors restricting the sustainable development of cotton production. The resistance to Verticillium wilt in Sea-island Cotton is strong and durable, but the mechanism of Verticillium wilt resistance is still not very clear. Research shows that Cotton has Adult Plant Resistance (APR) in resistance to Verticillium wilt, however the molecular mechanism of APR to Verticillium wilt is not clear, and related research has been rarely reported. We found that some genes associated with Verticillium wilt resistance in Sea-island Cotton have significant differences in the expression of adult plant stage and seedling stage. In this project, we will use the introgression lines of Gossypium hirsutum with Gossypium barbadense and resistant resources of Gossypium barbadense, and adopt the approach of -omics in combination with functional verification technology, to identify genes and miRNAs related to APR to Verticillium wilt in Cotton, to find out the expression pattern in adult plant stage and seedling stage respectively, verify the biological function of the key genes such as GbMAPKKK et al.. We Combine analysis of signal transduction pathways in model plant mutants, ascertain the network relationship and interaction between different signal transduction pathways, to reveal the molecular mechanism of APR to Verticillium Wilt in Sea-island Cotton, and provide theory basis and new approach for molecular breeding in resistance to Verticillium wilt in cotton. It is of great theoretical and practical significance for effective control of Verticillium wilt in cotton and promotion of sustainable development of cotton production.

由于主要栽培种陆地棉缺乏黄萎病有效抗源，棉花黄萎病已成为棉花生产可持续发展的主要障碍之一。海岛棉黄萎病抗性强而持久，但抗黄萎病机制仍不很清楚。研究表明，棉花对黄萎病具有成株抗性（APR），但相关成株抗性的分子机制尚不清楚，国内外研究罕见报道。我们研究发现某些海岛棉抗黄萎病相关基因在成株期和苗期的表达具有显著差异。本项目拟利用高抗陆海渐渗系和海岛棉抗源材料，采取基因功能验证和组学相结合的技术途径，鉴定获得棉花黄萎病成株抗性相关的基因及miRNAs，弄清其在成株期和苗期的表达模式，验证相关基因(如GbMAPKKK及其他候选基因)的生物学功能，结合模式植物抗病相关突变体的信号转导途径分析，诠释成株抗性相关的信号转导途径的网络关系与交互作用，以揭示海岛棉黄萎病成株抗性分子机理，为陆地棉黄萎病分子育种提供理论依据和新路径，对有效控制黄萎病危害、促进棉花产业可持续发展具有十分重要的理论和实践意义。

棉花抗黄萎病机制迄今仍不清楚，主要栽培种陆地棉抗黄萎病品种缺乏，严重制约棉花生产可持续发展。本项目利用高抗和感黄萎病的陆海渐渗系材料CSSL-1和CSSL-4及其他高抗黄萎病材料开展棉花黄萎病成株抗性相关基因的鉴定与功能研究。首先以黄萎病菌V991侵染抗感陆海渐渗系幼苗于成株期（初蕾期）取样进行RNA-seq分析，筛选出系列抗黄萎病相关的circRNAs，mRNAs与miRNAs。结果表明，共鉴定出686个棉花新的circRNAs，在CSSL-4中差异表达的circRNAs数量大约是CSSL-1的2倍；但在CSSL -1中差异表达的水平几乎都比在CSSL-4中的高，说明差异表达circRNAs可能在棉花对黄萎病应答反应中起重要作用。分析发现，在stimulus response项中，大多数circRNAs的来源基因是NBS编码基因，而这些NBS基因中的大多数是差异表达circRNAs的来源基因。结果显示，NBS编码基因可能在棉花抗黄萎病中起重要作用，它们可能是通过circRNAs调节而起重要的抗病作用。同时，我们从亚洲棉、雷蒙德氏棉、陆地棉和海岛棉基因组中分别鉴定出246、365、588和682个NBS编码基因；发现亚洲棉与陆地棉；雷蒙德氏棉与海岛棉的NBS编码基因具有更相近的基因结构、氨基酸序列、共线性、外显子数量，表明陆地棉从亚洲棉中继承了更多的NBS编码基因，而海岛棉从雷蒙德氏棉中继承了更多的NBS编码基因。NBS编码基因的非对称性进化可以帮助解释为什么海岛棉更抗黄萎病，亚洲棉与陆地棉却易感黄萎病；其中TNL基因可能具有重要的抗黄萎病作用。我们对棉花3个栽培物种的TIFY基因家族分析及JAZ4基因功能研究显示JA信号途径参与抗黄萎病响应。同时,我们整合PacBio等技术获得了高抗黄萎病的二倍体澳洲棉的高质量基因组图谱，利用高抗黄萎病的澳洲棉和感病亚洲棉采用多组学技术筛选出棉花抗黄萎病相关的CBP1，CCD7,bHLH19/25等基因。对抗病候选基因的系列功能研究结果表明，GbRbohD，GbNAC1,GbCaMBP,GbABR1,GhbHLH19/25,GauCBP1，GauCCD7是棉花黄萎病抗性的正调控基因，而GbCYP94C1，GhJAZ4是负调控基因，不同的抗病基因响应不同的激素信号应答。本项研究成果为棉花抗黄萎病分子育种提供了重要理论依据和基因资源。