南极菲尔德斯半岛附近海域表层海水氨氧化古菌多样性及其富集培养

Planktonic Crenarchaea are thought to play a key role in chemolithotrophic ammonia oxidation, a critical step of the marine nitrogen cycle. The purpose of this study is to obtain abundance, phylogenetic composition of Crenarchaea and ammonia-oxidizing Archaea (AOA) in the coastal water samples collected off Fields Peninsula, Antarctica over 2 years. To gain our object, three works are needed to be done. 1) to assess the relative importance of Crenarchaea in ammonia oxidization in the coastal water by examination of Crenarchaeal 16S rRNA and amoA genes, amoA transcript abundances and the composition of GDGTs (Glycerol Dialkyl Glycerol Tetraethers); 2) to obtain the phylogenetic composition of Crenarchaea and AOA in seawater by establishing Crenarchaeal 16S rRNA and amoA genes clone libraries; 3) to provide the direct physiological evidence for ammonia oxidation of marine Crenarchaea by enrichment culture and characterization of AOA from the coastal water. Our results would extend studies limited so far to temperate and tropical waters and the deep sea, provide a basis for assess their potential contribution to nitrogen cycling in pole oceans, and contribute to our understanding of their metabolic diversity.

浮游泉古菌在海洋氮循环关键环节--无机化能自养的氨氧化过程中发挥着重要作用，因此成为海洋微生物生态学研究的一个前沿热点。相对于中、低纬度地区海域，涉及极区海洋中氨氧化古菌多样性及其富集培养的研究甚少。本课题拟连续2年采集南极菲尔德斯半岛长城湾、阿德雷湾表层海水样品，对其进行氨氧化古菌的丰度、遗传多样性分析及其富集培养。采用实时荧光定量PCR检测泉古菌16S rRNA基因以及amoA基因转录丰度，结合膜脂组分分析以及海水中营养盐含量，确定泉古菌参与海水中氨氧化作用的程度。通过构建和分析古菌16S rRNA和amoA基因文库，获得海水中古菌和氨氧化古菌遗传多样性。经过3-4年的富集培养、传代和检测，获得以氨氧化古菌为主体的富集培养物，并对其进行细胞形态、生理生化特性分析，初步了解其氨氧化作用机制。

浮游泉古菌在海洋氮循环关键环节--无机化能自养的氨氧化过程中发挥着重要作用，因此成为了海洋微生物生态学研究的一个前沿热点。相对于中、低纬度地区海域，涉及极区海洋中氨氧化古菌多样性及其富集培养的研究甚少。本课题组成员先后参加了中国第29次、第30次和第31次队南极科学考察，采集了南极长城站附近表层海水样品，完成了海水理化性质分析、表层海水DNA或者RNA 提取、古菌16S rRNA 和amoA 基因文库构建、测序和分析，并以海水为初始接种物多次尝试氨氧化古菌富集培养。454高通量测序结果表明，表层海水中共检测到15个以上的细菌门，其中蓝细菌/叶绿体（Cyanobacteria/Chloroplast）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形细菌门（Proteobacteria）占据明显优势。而在变形细菌门中，Alpha、Gamma亚型的变形细菌序列在各站均占优势；表层海水中能检测到广古菌和泉古菌序列，其中广古菌占据明显优势（≥75%），泉古菌序列所占比例较小，尤其是奇古菌（中温泉古菌）序列所占比例更小；海水中古菌amoA基因序列分别为奇古菌门、泉古菌门和少部分未分类的古菌，其中奇古菌amoA基因序列在各站位表层水中占优势，奇古菌amoA基因序列中归属于氨氧化古菌Nitrosopumilus maritimus为优势类群。对表层海水提取的DNA 进行了实时荧光定量PCR，结果表明，每毫升表层海水中泉古菌16S rRNA基因拷贝数在102-105之间，比古菌amoA基因拷贝数高1-2个数量级；古菌amoA基因拷贝数对泉古菌16S rRNA基因拷贝数的比值为0.01-0.5之间。因此可以推断南极长城站表层海水中氨氧化古菌丰度较低。经过3年多的富集培养、传代和检测，未获得以氨氧化古菌为主体的富集培养物，因此未能对其进行细胞形态、生理生化特性分析。