荧光探针标记β淀粉样蛋白应用于氯胺酮所致认知功能障碍的机制研究

The situation that the new-type drugs, such as ketamine "recreational abused", have been widespread in Yunnan province, especially in border area, have made drug control and drug treatment face the new challenge. The imperatives of many researchers is to establish the efficient method to research the neural mechanism of new-type drugs addiction. It is believed that β-amyloid mediated in phycological dependence and congnitive disorder following ketamine administration, but the mechanism remains unclear. In our this project, we mimic the model of human following ketamine "recreational abused", that is, establishing the mice model of ketamine and ethanol abused under two different drug delivery systems. The evaluation of β-amyloid in prefrontal cortex and hippocampus mediated in cognition impairment following ketamine recreation abused in mice will be accomplished, through Morris water maze, ELISA, Immunohistochemistry. Also, the novel 1,8 naphthyridine-based BODIPY complex will be evaluated through binding to different forms of β-amyloid in vitro and vivo experiment. And imaging the β-amyloid will be realized through in vitro fluorescence staining of mice brain section, fluorescence immunohistochemical staining of brain tissue section, and vivo histology. The first example of visualized research β-amyloid in cognitive dysfunction under ketamine "recreational abused" in mice will be realized through neruo cell experiment, in vitro and in vivo fluorescence imaging for β-amyloid. This will lay the foundation of understand neural mechanism of ketamine abused and provide novel research methods.

"娱乐性滥用"氯胺酮等新型毒品对云南边疆地区的禁毒、戒毒工作产生了新的挑战，迫切需要建立新型毒品的神经机制研究方法。氯胺酮可导致滥用者精神依赖和认知功能障碍，β淀粉样蛋白被认为可能参与介导其中枢神经损害作用，但其作用机理尚不清楚。本项目模拟人类"娱乐性滥用"氯胺酮建立小鼠模型，即氯胺酮和乙醇两种不同给药模式，采用Morris 水迷宫实验、ELISA技术、免疫组化技术，评价不同给药模式下对小鼠脑部前额叶皮质和海马脑区中β淀粉样蛋白的介导作用。通过体外细胞标记、离体组织标记、在体组织标记等实验评估新型基于1,8萘啶BODIPY类荧光分子探针标记β淀粉样蛋白的生物学特性，选择最佳荧光分子探针标记β淀粉样蛋白，通过离体和在体标记实验观察其在神经细胞的形态和定位变化，研究其与氯胺酮滥用所致认知障碍的相关性，实现对其神经作用机制的可视化研究，这将为认识氯胺酮认知障碍的神经机制研究奠定基础和提供新的方法

前期研究基础提示大鼠脑部相关脑区多巴胺释放的变化这一实验现象的背后是否是由于有β-淀粉样蛋白和Tau蛋白磷酸化的参与和介导，因此，评价在氯胺酮成瘾大鼠模型中β-淀粉样蛋白的沉淀和Tau蛋白磷酸化是值得深入探索的研究内容。本项目模拟人类“娱乐性滥用”氯胺酮，建立氯胺酮/氯胺酮合用乙醇两种药物滥用大鼠模型。分别以海马、纹状体、前额叶皮质三个脑区为研究对象，采用rt-PCR技术探究Aβ和Tau蛋白磷酸化的相关编码基因BACE1、GSK-3β的mRNA表达；采用western blot方法检测Tau(pS396)、Tau(pS404)、Tau(pT23 1)、GSK-3β和p-GSK-3βSer9表达；采用免疫组化技术研究不同给药模式对大鼠三个脑去中β 淀粉样蛋白、Tau蛋白以及NMDA受体两个主要亚型GluN1和GluN2B的表达影响，评价不同给药模式下对大鼠脑部海马、纹状体、前额叶皮质中Aβ和Tau磷酸化的介导作用。实验结果表明，氯胺酮乙醇联用3月后，通过上调BACE1基因促进了大鼠纹状体中Aβ的沉积，该结果与前期基础相符即皮质-纹状体回路中多巴胺含量的上调和Aβ沉积之间有协同作用；6月后，通过上调了大鼠纹状体和海马区的GSK-3β基因促进了Tau蛋白的磷酸化表达。而氯胺酮单独滥用3月后，大鼠海马、纹状体、前额叶皮质脑区呈现不同程度的Aβ沉积和Tau蛋白磷酸化；6月后对大鼠三个脑区中Aβ的沉积和Tau蛋白磷酸化呈现出抑制作用。通过体外人源蛋白标记，供筛选了6个不同母体结构的1,8-萘啶类BODIPY荧光分子探针化合物与β-淀粉样蛋白的标记性能。化合物C3与Aβ42标记后荧光强度增强155%。因此，可以化合物C3的结构为母体结构，根据标记Aβ斑块的荧光探针化合物的结构特点，设计两类不同结构特点的化合物，即A-D型（Acceptor-Donor，受体-给体型）和D-A-D型（Donor-Acceptor-Donor，给体-受体-给体型）。实现对其神经作用机制的可视化研究，这将为认识氯胺酮认知障碍的神经机制研究奠定基础和提供新的方法。项目资助发表SCI论文3篇，待发表论文2篇，申请国家发明专利2项。培养硕士研究生2名。