Nm23-H1通过DSBs修复途径介导肺癌放疗抵抗的机制研究

Nm23-H1, as a tumor metastasis suppressor gene, is found to have DNA damage repair function in recent years, but the exact mechanism is not clear. Our previous studies showed that Nm23-H1 involved in base excision repair pathway through interaction with APE1. The study also found that the Nm23-H1 level of lung cancer cells after X-ray irradiation was increased and transfered to nuclear, and clinical study suggested that there was correlation trend between high expression of Nm23-H1 and worse radiotherapy efficacy. As double strand break ( DSBs ) is the main damage form of irradiation, and repair of DSBs damage is the important factor of lung cancer radiation resistance，we put forward a hypothesis that Nm23-H1 involved in lung cancer radiation resistance through DSBs repair pathways. In this study, we adopt gene recombination, single cell gel electrophoresis, immunoprecipitation, in vitro kinase analysis, the I-SceI detection system and animal models, to explore the Nm23-H1 involving in DSBs repair mechanisms and its association with lung cancer radioresistance. This study will further enrich our understanding of the biological function of Nm23-H1, provide a new therapy target for lung cancer radioresistance,and has very important scientific significance and prospects of clinical application.

Nm23-H1作为肿瘤转移抑制基因近年研究发现其可能还具有DNA损伤修复功能，但具体机制不清楚。我们前期研究表明Nm23-H1可通过与APE1的相互作用参与碱基切除修复途径。研究同时发现X射线照射后的肺癌细胞Nm23-H1表达增加并向胞核转移，临床研究提示Nm23-H1高表达与肺癌放疗疗效差相关。而电离辐射所介导的DNA损伤以双链断裂（DSBs）为主，DSBs的修复又是决定肺癌放疗抵抗的重要因素。故此我们提出假说：Nm23-H1还具有参与DSBs修复的功能，并通过DSBs修复途径介导肺癌放疗抵抗。课题拟采用基因重组，单细胞凝胶电泳、免疫共沉淀、体外激酶活性实验、I-SceI检测系统、动物模型等实验技术，探讨Nm23-H1参与DSBs修复的具体机制及其与肺癌放疗抵抗的关系。本研究将进一步丰富Nm23-H1生物学功能，并为临床肺癌放疗抵抗提供新的治疗靶点，具有极其重要的科学意义和临床应用前景。

Nm23-H1作为肿瘤转移抑制基因近年研究发现其可能还具有DNA损伤修复功能，但具体机制不清楚。我们前期研究表明Nm23-H1可通过与APE1的相互作用参与碱基切除修复途径。研究同时发现X射线照射后的肺癌细胞Nm23-H1表达增加并向胞核转移，临床研究提示Nm23-H1高表达与肺癌放疗疗效差相关。而电离辐射所介导的DNA损伤以双链断裂（DSBs）为主，DSBs的修复又是决定肺癌放疗抵抗的重要因素。故此我们提出假说：Nm23-H1还具有参与DSBs修复的功能，并通过DSBs修复途径介导肺癌放疗抵抗。以下实验证明我们的假说通过基因重组构建了Nm23-H1的敲低株、核过表达株及突变株；克隆形成实验发现敲低Nm23-H1可增强人肺腺癌A549细胞对X射线的敏感性；单细胞凝胶电泳实验发现敲低Nm23-H1可加重DNA损伤，提示其参与DSBs的修复；免疫荧光实验发现敲低Nm23-H1组随着时间的延长γ-H2AX foci阳性细胞数较对照组多，说明敲低Nm23-H1组的DNA损伤更严重、Nm23-H1参与了肺癌的放疗抵抗；通过免疫共沉淀发现Nm23-H1可通过与DSBs修复相关蛋白 Ku80、NBS-1、Mre11相互作用来参与DSBs修复；离子对反相高效液相色谱实验发现Nm23-H1可通过其NDPK激酶活性对核苷酸池的影响参与DSBs的修复， Nm23-H1低表达组在X线照射后胞内dCTP、dGTP和dTTP含量均减少，且随着时间的延长，DNA损伤更严重，放疗更敏感；免疫印迹试验发现NM23-H1核过表达细胞株在X-ray照射后能使S1981-ATM、 pS15-p53、pT68-Chk2表达均增强，而NM23-H1敲低株则使以上三种磷酸化蛋白少表达甚至不表达。可见NM23-H1能通过促进ATM、p53、chk2磷酸化的激活来促进DNA损伤修复；通过动物模型，Nm23-H1敲低组抑瘤率=60.36%，对照组抑瘤率=25.76% (P<0.01)证实了Nm23-H1有放疗抵抗的作用。本研究进一步丰富了Nm23-H1生物学功能，并为临床肺癌放疗抵抗提供新的治疗靶点，具有极其重要的科学意义和临床应用前景。