曲酸介导的氧化胁迫调控斑玉蕈原基发育的分子机制研究

The inoculation for mycelium growth needed 30-45 days and the mycelium maturated needed 60-70 days in Hypsizygus marmoreus, which made its scale production efficiency is lower than other mushrooms. In our previous study of factory strain, we found that adding kojic acid (KA) after scratching could stimulate primordium formation and increase the numbers of maturated fruiting bodies, and shorten culture cycle 25 days in H. marmoreus. Scratching was mechanical damage stress for edible mushrooms. Researchers have proved that KA had the ability to scavenge reactive oxygen species and enhance fungal tolerance to oxidative stress. This project will study the relationship between KA synthesis and the intracellular oxidation level of H. marmoreus by adding KA and silence-expressing the key gene in KA synthesis to up-regulate or down-regulate the KA synthesis, and will clarify the molecular mechanism of KA-mediated oxidative stress induced primordium development in H. marmoreus. This project will lay foundation for shortening cultivation period by regulating the intracellular oxidation level in H. marmoreus and it is significance for economic in large scale production of edible mushrooms; moreover, it is important theoretical significance that expand our view for the fungal KA biosynthesis and its physiological significance.

斑玉蕈发菌需30-45天，菌丝成熟达到有出菇能力需60-70天，这使得斑玉蕈规模化生产效率相对其他食用菌较低。我们前期以斑玉蕈工厂化菌株为研究对象，发现搔菌后添加曲酸诱导斑玉蕈原基形成和增加成熟子实体数，并缩短其栽培周期25天。搔菌是对食用菌造成的一种机械损伤胁迫。已有研究证明曲酸具有清除自由基和增强真菌抵御外界氧化胁迫的能力。本项目将进一步通过外源添加曲酸反馈诱导曲酸的合成和沉默表达曲酸合成的关键基因分别上调和下调曲酸的合成，研究曲酸合成水平与细胞内氧化水平的关系，阐明曲酸介导的氧化胁迫调控斑玉蕈原基形成的分子机制。本项目的开展将有望通过调控细胞内氧化水平缩短斑玉蕈栽培周期，对斑玉蕈规模化生产具有重要的经济意义；同时扩展了人们对真菌次级代谢产物的合成及其生理意义的认识，具有重要的理论意义。

本项目前期研究发现搔菌后外源添加曲酸促进斑玉蕈原基提前发生和提高斑玉蕈子实体产量。在此基础上，分别通过外源添加曲酸和沉默曲酸合成途径中的关键基因Zn(II)(2)Cys(6)的手段，研究了斑玉蕈菌丝细胞内的曲酸含量、抗氧化能力的变化和基质降解酶活性等生理生化指标的变化情况。研究发现，搔菌后外源添加曲酸，斑玉蕈内源曲酸含量在不同发育时期出现先增加后降低的趋势，而超氧阴离子含量比对照组低，过氧化氢含量反而比对照组高；同时，抗氧化酶中的超氧化物歧化酶活性高于对照组，过氧化氢酶活性低于对照组。外源添加曲酸后，与基质降解相关的漆酶（LaC）、木质素过氧化物酶（LiP）和錳过氧化物酶（MnP）活性显著地被曲酸提高，曲酸处理组的木质纤维素含量比对照组减少的更多。另外，对曲酸合成途径中的关键基因Zn(II)(2)Cys(6)进行了沉默表达后发现，斑玉蕈细胞内的活性氧水平显著地降低，抗氧化能力降低和菌丝降解基质能力降低。进一步研究发现，沉默Zn(II)(2)Cys(6)后斑玉蕈细胞内的线粒体形态畸变，线粒体复合物活性显著地比对照组低，并且沉默转化子应对氧胁迫（8mM H2O2）更加敏感。由这些结果可知，曲酸可以有效地清除超氧阴离子，而过氧化氢含量不仅受曲酸调控更多地受斑玉蕈自身发育周期的调控，同时推测曲酸可能是通过调控斑玉蕈线粒体功能，进而影响了斑玉蕈抗氧化能力和基质降解能力。本项目的完成不仅阐述了曲酸调控斑玉蕈原基发生的分子机制，还为探究次级代谢产物在真菌生长发育中的功能奠定基础；同时，在食用菌增产增效研究上也具有重要的意义，为食用菌增产剂的研发提供新的思路和方向。