平滑肌祖细胞在哮喘气道重塑中的作用及其机制研究

近年外周血中发现一类细胞―平滑肌祖细胞（SPC）。它被认为是平滑肌前体细胞，主要源自骨髓，同时具有干细胞和平滑肌细胞的部分特征。现研究表明它是血管重构过程中新生内膜平滑肌细胞的重要来源。我们前期研究发现哮喘小鼠外周血中CD34、MHC表达阳性的单个核细胞增多，提示存在SPC增多可能，SPC尾静脉注射后示踪提示小鼠气道平滑肌层部分细胞来自外周血，因此推测SPC在气道重塑中亦可能发挥作用。本研究拟通过检测哮喘大鼠与正常大鼠外周血中平滑肌祖细胞含量的差异，观察其与哮喘状态的相关性；再以雌性哮喘大鼠为研究对象，经尾静脉注入雄性来源SPC，以原位杂交检测气道平滑肌层和分离纯化后的气道平滑肌细胞中雄性来源细胞的比例，观察平滑肌祖细胞在雌性哮喘大鼠气道的定植和分化情况；通过西司莫罗抑制平滑肌祖细胞，观察哮喘气道重塑的相应改变，力求阐明外周血平滑祖细胞参与哮喘气道重塑的情况，为防治哮喘气道重塑提供新思路。

我们通过卵蛋白雾化吸入成功制作哮喘动物模型，哮喘模型组小鼠用1％卵蛋白（OVA）超声雾化吸入，连续激发6周，至咳嗽、喷嚏、气喘。证明大鼠哮喘动物模型制作成功。卵蛋白雾入吸入制作哮喘动物模型促进大鼠外周血中单个核细胞表达CD34以及MHC显著增加，提示平滑肌祖细胞的增加。已成功采用全骨髓贴壁法分离雄性大鼠骨髓间充质干细胞，骨髓单个核细胞接种于培养瓶后，细胞呈圆型，大小不一，悬浮于培养液中。24 h后部分细胞开始贴壁，呈圆形或多角形。证明成功分离大鼠MSC。其次，我们检测PIC对支气管哮喘小鼠模型气道黏膜屏障的影响及其与GEF-H1/RhoA/ROCK 信号通路的相关性。并且观察了 PIC 对支气管哮喘小鼠气道黏膜屏障的影响，同时检测GEF-H1/RhoA/ROCK信号通路活性及其与哮喘小鼠气道黏膜屏障损伤的相关性。我们首先建立PIC 诱导支气管哮喘模拟病毒感染小鼠模型，并设立对照，共包括对照组、PIC 刺激组、支气管哮喘+PBS 刺激组、支气管哮喘+PIC 刺激组等四组，激发末次后24 小时收集标本，再通过免疫组化，最后运用激光共聚焦显微镜观察气道黏膜中ZO-1 蛋白表达，并比较组间差异；另外也采用了RT-PCR及Western blot 技术检测小鼠肺组织中GEF-H1、RhoA及ROCKmRNA及蛋白含量，并比较组间差异；在后续的实验中，我们通过从鼻腔外源性分别给予ROCK 抑制剂（Y27632）、RhoAsiRNA 以及GEF-H1siRNA预处理后，观察小鼠气道黏膜中ZO-1 蛋白表达及肺组织中GEF-H1、RhoA 及ROCK mRNA 及蛋白含量。