新型海洋来源齿毛菌漆酶的表达、调控及污染物降解机理研究

In search of new laccases with desired properties, a novel laccase-producing fungal strain, Cerrena sp. HYB07, was isolated from a mangrove swamp in Fujian Province and bred selectively. Laccases from HYB07 are alkaline, halotolerant and stable over a wide range of pHs and temperatures and therefore may have broad applications in treatment of marine pollutants. The proposed project aims to study the HYB07 laccase family in the following aspects: 1) cloning of the nine laccase genes, their heterologous expression in yeast Pichia pastoris and analysis of the enzymatic properties of the recombinant proteins; 2) with detailed promoter analysis and transcription and enzyme profiling, transcription regulation of the laccase genes will be elucidated for subsequent optimization of fermentation conditions and their applications; 3) studying the degradation and detoxification effects of the laccases on azo, anthraquinone, indigo, triphenylmethane and polycyclic aromatic hydrocarbon compounds, identifying the products and the underlying mechanisms of action as well as establishing core technical parameters for laccase-mediated marine pollution control; 4) realizing high-level expression of the laccase(s) with desired enzymatic properties and application potential. The research findings will serve to further our understanding on these Cerrena-derived laccases and provide a theoretical basis for their future study, industrial production and applications.

从福建红树林筛选，并通过选育得到一株齿毛菌（Cerrena sp.）HYB07菌株，该菌株所产碱性耐盐漆酶，性质稳定独特，在海洋污染物降解方面有广阔的应用前景。本课题为应用基础研究，拟就以下几方面开展研究：1）系统研究HYB07菌株中漆酶家族9个成员的基因序列与蛋白、酶学性质，以便选择性质优良的漆酶进行高效表达和应用研究；2）结合漆酶基因启动子的生物信息学分析和基因转录谱，考察漆酶基因的转录调控机制，服务于后续发酵产酶及应用条件优化；3）研究漆酶同工酶在降解偶氮、蒽醌、靛类、三苯甲烷、多环芳烃等化合物方面的效果、产物和机制，建立其在海洋污染防治方面的核心技术体系；4）构建漆酶的高效表达体系，为其下一步的研究、生产和应用奠定基础。

基于实验室前期获得的一株高产漆酶的白腐真菌——齿毛菌（Cerrena sp.）HYB07菌株，就其漆酶家族的序列、性质和转录调控、漆酶发酵生产工艺、漆酶固定化及在生物降解中的应用等方面进行了研究。研究结果如下：.1）齿毛菌HYB07菌株共有漆酶同工酶基因15条，获得了其中11条cDNA序列并进行了生物信息学分析；漆酶同工酶含有高度保守的铜离子结合区和保守性低的底物结合区。选取5条同工酶基因在毕赤酵母中进行了异源表达。对分离纯化得到的同工酶进行性质表征，发现它们表现出不同的酶学性质和底物范围。.2）HYB07漆酶的高产仅需铜离子和高碳高氮水平，不受营养阻遏、无需有机化合物诱导。对同工酶基因的qRT-PCR研究发现，在不同发酵阶段和培养基成分下，同工酶基因表现出特异性转录谱，可能与其启动子区域内顺式作用元件的种类、数目有关。Lac7是主要表达的漆酶基因，且其转录水平与菌株产酶水平正相关。Lac7的转录受铜离子和高碳高氮水平诱导。.3）利用海藻酸钠包埋法、壳聚糖交联法、交联酶聚集体（CLEAs）和磁性交联酶聚集体（M-CLEAs）这4种方法固定化漆酶。固定化漆酶的热稳定都较游离漆酶有显著提高，且可重复利用5次以上。漆酶CLEAs和M-CLEAs漆酶的酶活回收率较高，且底物催化效率较游离漆酶更高。将游离漆酶和固定化漆酶应用于染料、多环芳烃、塑化剂、激素和抗生素等有机污染物的降解，发现HYB07漆酶有良好的降解和脱毒性能。利用LC-TOF MS鉴定得到孔雀石绿和四环素的转化产物，推测漆酶介导的降解途径。.4）在5 L发酵罐中建立了漆酶的发酵生产工艺，对发酵培养基、溶氧、搅拌器、接种量、温度、pH、补料等进行优化。最终得到发酵192小时，漆酶酶活最高可达862.3 U/mL。.本课题研究表明，HYB07菌株的漆酶产量高、发酵周期短，且所产漆酶底物范围广、催化活力高、稳定性好，因此具有重要的工业生产价值。本课题部分研究成果已发表SCI论文9篇，申请国家发明专利1项。本课题研究为后期破译HYB07漆酶高效表达的分子机制奠定了坚实基础，同时也为漆酶的工业化生产和应用提供了理论依据和技术支持。