油松胚珠发育关键基因的表达组织特异性及功能研究

研究胚珠发育可以揭示许多具有普遍意义的发育机制，利用分子遗传分析人们已经初步建立了拟南芥胚珠发育的基因调控网络，但尚需进一步揭示相关基因的调控机制。对于非模式植物以及木本植物的相关研究有待进一步开展。本项目以油松可育系胚珠和28号雌性不育系胚珠为研究对象, 采用先进的LCM（激光捕获显微切割）、基因芯片、Super SMART cDNA合成及2D-DIGE（荧光差异双向电泳）等技术，建立发育关键阶段的组织特异转录组、差异表达蛋白质组数据库及抑制性消减杂交cDNA文库，系统分析胚珠发育的游离核分裂、雌配子体细胞化及颈卵器分化等发育阶段基因表达的组织和时间特异性，鉴定和确定调控油松胚珠发育的关键基因及其功能，解析油松胚珠发育的基因调控机制，初步建立裸子植物胚珠发育的分子调控网络模式。

油松是我国重要绿化造林针叶树种，因其营养繁殖困难，主要用种子造林。而在许多油松种子园内，胚珠败育和球果产生空瘪粒的现象普遍，严重影响油松种子的产量和质量。因此，研究油松胚珠发育的分子调控机制，对于建立油松人工制种技术和提高种子产量和质量具有重要的理论与实践意义。.本项目以油松可育系和雌性不育系胚珠为材料, 采用LCM（激光捕获显微切割）、微量RNA提取及线性扩增技术、2D-DIGE（荧光差异双向电泳）和iTRAQ技术以及转录组高通量测序等技术，建立发育关键阶段及组织特异转录组、差异表达蛋白质组数据库及抑制性消减杂交cDNA文库，系统分析胚珠发育的游离核分裂、雌配子体细胞化及颈卵器分化等发育阶段基因表达的组织和时间特异性，鉴定和确定调控油松胚珠发育的关键基因及其功能，解析油松胚珠发育的基因调控机制。课题组完成了本课题的基本研究内容，基本达到了预期目标。成功建立了LCM分离单倍体细胞雌配子体与周围二倍体细胞组织的技术体系，建立了雌配子体及其周围二倍体细胞组织中微量RNA的提取、分离和线性扩增技术体系，获得了相应的转录组图谱；成功建立了油松胚珠蛋白质2D-DIGE技术体系，分析了油松雌配子体细胞化关键时期的差异表达蛋白质组，获得了差异表达蛋白质组谱，确定了与油松雌配子体游离核细胞化过程相关的调控因子，初步提出来裸子植物油松雌配子体游离核细胞化的分子调控理论。.为克服油松无基因组参考的困难和材料少且小，RNA极少的困难，课题组利用Illumina HiSeqTM 2000测序平台分别对雌配子体游离核处于分裂前期、中期、后期的油松胚珠进行高通量转录组测序，得到了约70.7M reads，共计14.1G bp的数据量，组装成63,449 unigenes。基于转录组数据，探索了可育系与不育系油松胚珠在雌配子体发育的三个时期的基因差异表达情况，获得大量特异或非特异调控胚珠发育的候选基因。采用相对和绝对定量的等量异位标签iTRAQ技术，对处于游离核前期和后期的不育系和可育系的油松胚珠4个样本进行差异蛋白质组分析，最终鉴定到unique peptide 19305个，protein group 4199个，其中各通道标记标签皆有定量信息的蛋白质有4192个，得到四组有效比对数据，每组数据都包含400多个差异表达蛋白质，并对这些差异蛋白质进行了初步的功能注释。该研究将促进植物发育基因调