污水处理系统中以质粒和整合子为载体的抗生素抗性基因的分子传播机制及抗性基因的归趋

针对污水处理系统作为抗生素抗性基因的重要污染源，本研究拟采取野外采样和室内模拟相结合的方法，拟选取sul1,sul2,tetW和qnrA作为研究对象，系统开展污水处理系统中质粒和整合子为载体的抗生素抗性基因的分子传播机制及抗性基因的归趋研究。首先明确污水处理系统中质粒和整合子的分布特征及整合子携带ARGs基因型。通过研究不同处理单元抗性基因的消长动力学以及受不同处理工艺的影响揭示抗性基因在污水处理系统的归趋。实验室模拟下，重点考察污水处理工艺和细菌生长条件对质粒和整合子为载体的ARGs传播效率的影响机制，以及ARGs在抗性细菌中的持久性，特别是对F质粒携带抗性基因的分子传播机制的探讨，是揭示ARGs传播的关键，也极有可能成为指示并评估环境中ARGs传播风险的可靠标志。该研究对于遏制ARGs 在污水处理系统中传播扩散、采取有效措施控制日趋严重的细菌耐药性问题具有重要的的理论及现实意义。

近几年多起由耐药细菌传播引起的公共健康安全事件，比如欧洲毒黄瓜、超级细菌NDM-1事件等，引起了人类社会的极度恐慌，抗生素抗性基因(ARG)作为新兴污染物在环境等领域日益受到关注。在环境领域，污水处理系统是环境ARG来源的重要污染源之一。研究中，我们对选择的污水处理厂的各个处理单元采集污水和活性污泥样本，优化了DNA提取方法并建立优化了胞外和胞内DNA分别提取的方法，优化了ARGs的PCR定性和定量检测分析方法等，进行了五大类38 种抗性基因亚型、以及质粒指示基因的检测分析，有24种抗性基因(tetA，tetB，tetC，tetD，tetE，tetG，tetH，tetL，tetM，tetO，tetQ，tetS，tetT，tetW，tetX，sul1，sul2，sul3，qnrB，qnrD，qnrS，ermB，ermC, NDM-1 genes)和三种指示基因(traA，traF和intIL)在各个单元全部检出，包括四环素类15种、奎诺酮3种、大环内酯类2种、磺胺类3种、碳青霉烯类1种、自主传递质粒遗传标记基因traA(编码细菌性毛结构蛋白)、RP4等常见环境质粒的结构基因traF以及整合子整合酶基因intIL。 . 通过质量流等方法，我们分析了五大类抗性基因(四环素、喹诺酮、磺胺、大环内酯和碳青霉烯类)在污水处理各个单元的变化，我们发现生物处理单元显著富集ARGs，富集增长率达7-120%，最终ARGs总量的约90%进入废弃污泥，经过污水处理厂排放的ARGs(包括出水和废弃污泥)显著高于进水中ARGs2-10倍(p<0.05)。在两个污水处理厂中均检出抗性基因NDM-1，并分离到其携带者“超级细菌”(其中包括致病菌和条件致病菌)，NDM-1 抗性基因在污水生物处理单元被显著富集(p<0.05)，其中同时含有大量的接合性质粒(IncQ, IncP等)和一类整合子，NDM-1基因通过出水和污泥排放进入环境。在实验室模拟试验中，分离得到的超级细菌能够快速将NDM-1基因传递给环境菌群。我们的研究揭示了城市污水处理系统是环境抗性基因污染的重要点源，及ARGs的富集和分布特征，为制定措施消减抗生素抗性基因污染提供了科学依据；并首次在城市污水处理系统发现了对人体健康构成极大威胁的“超级细菌”及其编码的抗性基因NDM-1，对其公共健康安全风险提出警示。