脱氧胞苷激酶基因沉默对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞迁移和侵袭功能影响的机制研究

Kinase is the research focus of drugs. Deoxycytidine kinase (DCK) is a key enzyme in the biosynthesis of nucleotide salvage pathway. We found in previous work DCK gene silencing can inhibit RA FLS cell migration, invasion, suggesting that DCK may be a new target for diagnosis and treatment of RA. In the present study, we aimed to collect the knee joint synovial tissue biopsy of different activity levels in patients with RA, while collecting synovial tissue of OA. The expression levels of DCK gene in FLS cells was determined by quantitative real-time PCR analysis and Western blot. We will analyze correlation of DCK gene and RA. Collagen-induced arthritis rats (CIA) were treated with different doses of DCK shRNA lentivirus fluid or placebo. We will collect peripheral blood, spleen and lymph nodes in different periods. Through the analysis of DCK in animal model and patients in RA pathogenesis, provide a theoretical basis for clinical RA to find new drug target.

激酶是目前药物的研发热点，脱氧胞苷激酶(DCK)是脱氧核苷酸生物合成补救途径中的关键酶，我们在前期工作中发现DCK基因沉默能够抑制RA FLS细胞迁移、侵袭能力，提示DCK可能是RA诊断治疗的一个新的靶点。本课题组拟收集不同活动程度RA患者的滑膜组织，同时收集OA滑膜组织，分离滑膜细胞，检测DCK基因的表达水平。收集RA患者病情资料，分析DCK基因与病情的相关性。建立大鼠胶原诱导关节炎（CIA）模型，分别给予安慰剂和不同剂量DCK shRNA 慢病毒液，比较各组大鼠的发病情况，在不同时期收集外周血、脾脏和淋巴结，分析抑制DCK后大鼠CIA模型的病情变化和可能机制。通过分析DCK在动物模型及RA患者中的发病机制，为临床RA找寻新的药物靶点提供理论依据。

背景和目的：类风湿关节炎（RA）是最常见的自身免疫性疾病之一，致残率高。脱氧胞苷激酶（DCK）是脱氧核苷酸生物合成补救途径中的关键酶，本课题组在前期工作中明确了DCK shRNA基因沉默具有特异性抑制RA FLS细胞的迁移和侵袭能力。本实验拟对DCK在RA患者中的发病机制进行探索，为临床RA找寻新的药物靶点提供理论依据。.方法：收集活动性类风湿性关节炎患者和骨关节炎患者关节置换术后的滑膜组织， 用Realtime PCR方法检测DCK基因在RA和OA患者的滑膜组织中的mRNA的表达水平，比较两者之间的差异。将部分滑膜组织制成石蜡切片，进行免疫组化和免疫荧光实验实验，检测RA患者RA和OA患者的滑膜组织免疫组化和免疫荧光实验中DCK的表达情况，并进行定量分析检测DCK基因在RA和OA患者的滑膜组织中表达水平差异。收集RA和OA患者的外周血，流式细胞仪检测外周血中CD4、CD8、CD14、CD20各群细胞中DCK的表达。用Realtime PCR检测外周血PBMC细胞中RA和OA患者的DCK在mRNA水平上表达差异。外周血分离出PBMC细胞后用磁珠分选出目标细胞群, 用Realtime PCR检测RA和OA患者的外周血目标细胞中DCK表达差异。.结果：RA患者的滑膜组织中DCK在mRNA水平上的表达明显高于OA患者（P<0.05）。在免疫组化中RA患者滑膜组织中DCK的表达高于OA患者，同时高于正常对照，定量分析差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光染色中表现出RA患者滑膜组织细胞中CD14细胞亚群DCK基因的表达高于CD20、CD3细胞亚群，同时高于OA患者及正常对照，定量分析差异具有统计学意义（P<0.05）。RA患者的外周血PBMC细胞中DCK在mRNA水平上的表达与OA患者无显著差异（P=0.1512），然而在CD14细胞亚群中DCK在mRNA水平上的明显高于骨关节炎患者（P=0.0479）（图6），差异具有显著的统计学意义。.总结：DCK基因在RA患者的滑膜组织和外周血的CD14细胞亚群中表达显著增高，DCK基因可能是RA治疗的新的一个靶点。