具有免疫治疗作用的双特异性靶向融合蛋白dFv/ePD-1抗肿瘤活性研究及其机制探讨

Tumor cells can escape from immunological surveillance and maintain immune tolerance，one of most important reason is immunosuppression generated by tumor cells in tumor microenvironment through PD-1/PD-L1 inhibitory signal pathway. And the increased levels of gelatinase in tumor stroma have been attributed to cancer invasion and metastasis by destruction of basilar membrane and matrix integrity. So, effective inhibition of PD-1/PD-L1 cell signal pathway and gelatinase activity secreted in tumor stroma can improve the activity of antitumor immune response, and then to inhibit tumor growth and metastasis. The goal of this study is to develop a new immunotherapeutic bispecific fusion protein dFv/ePD-1 which contains gelatinase targeting antibody-based fragment dFv and PD-L1 targeting fragment ePD-1. Our early study showed that the dFv fragment had strong affinity to cancer cells and tumor tissues over-expressing gelatinase, and could inhibit the tumor growth by reduction of gelatinase enzyme activity. The other fragment ePD-1 is the extracellular section of PD-1, which has binding ability to PD-L1 expressed on tumor cells and block the immunosuppressional signal pathway of PD-1/PD-L1, then improving the proliferation and killing activity of CTL infiltrated in tumor microenvironment to enhance specific antitumor response. The new bispecific fusion protein dFv/ePD-1 can achieve effective treatment of tumor through the synergy of above functions. The successful implementation of the project will lay the foundation for the new method and strategy of tumor targeting immunotherapy.

恶性肿瘤逃避机体免疫监视和产生免疫耐受的重要原因之一，是肿瘤细胞能通过PD-1/PD-L1共刺激信号抑制肿瘤微环境中免疫细胞的活性，此外肿瘤细胞分泌的明胶酶能破坏基底膜和基质完整性，促进肿瘤侵袭和转移。通过阻断PD-1/PD-L1抑制性信号通路和抑制明胶酶活性，可望激发机体的抗肿瘤免疫功能，达到抑制肿瘤生长和转移的目的。本研究旨在研发一种新的具有免疫治疗作用的双特异性靶向融合蛋白dFv/ePD-1，本项目前期研究显示，dFv(靶向明胶酶的抗体片段)能特异性地将与其融合的蛋白片段靶向富集到肿瘤组织，与明胶酶结合并抑制其活性。而ePD-1(PD-1胞外段)能与肿瘤细胞膜上高表达的PD-L1结合并封闭PD-1/PD-L1信号通路，增强肿瘤特异性免疫应答。融合蛋白dFv/ ePD-1可通过上述两种功能的协同作用达到有效治疗肿瘤的目的。本项目的成功实施将为肿瘤的靶向免疫治疗提供新的策略和手段。

目的：PD-1是主要表达于肿瘤浸润性淋巴细胞CTL表面的免疫抑制性受体，它与表达于肿瘤细胞表面的配体PD-L1结合后，将诱导CTL分泌免疫抑制性细胞因子并导致其发生凋亡，由此失去杀伤肿瘤的作用。此外，明胶酶作为肿瘤细胞分泌的特异性蛋白水解酶，能够降解细胞外基质和内皮下基底膜，促进肿瘤侵袭和转移。因此，若能同时阻断PD-1/PD-L1信号转导途径并抑制明胶酶活性，可望能更有效地抑制肿瘤细胞的增殖和转移。本研究的目的是设计和制备一种融合蛋白dFV-ePD1，它由能抑制明胶酶活性的单链抗体ScFV片段和能阻断PD-1/ PD-L1相互作用的PD-1胞外段连接而成，随后测定融合蛋白dFV-ePD1对小鼠黑色素瘤细胞B16-F1的靶向结合能力及其对B16-F1生长的抑制作用。.方法：利用基因工程技术构建重组质粒pET30a(+)/dFV-ePD1和pET30a(+)/dFV，将上述质粒转化原核表达菌后，IPTG诱导带有His-tag的目的重组蛋白（dFV-ePD1和dFV）表达并用镍柱亲和层析法纯化。明胶酶谱法检测复性后的融合蛋白对明胶酶活性的抑制作用，细胞免疫荧光和免疫组化法分别检测重组蛋白与黑色素瘤细胞及临床组织芯片黑色素瘤组织的结合能力；流式细胞术分析重组蛋白对黑色素瘤的亲和力；MTT、细胞划痕实验和Transwell分别检测重组融合蛋白对小鼠黑色素瘤细胞体外增殖和迁移的抑制作用。体内利用黑色素移植瘤动物模型验证融合蛋白的抗肿瘤活性。.结果：（1）成功构建pET30a(+)/dFV-ePD1和pET30a(+)/dFV原核表达质粒，并在E.coli中表达和纯化出融合蛋白；（2）复性后的融合蛋白dFV-ePD1能抑制明胶酶活性，其对明胶酶的抑制作用随蛋白浓度升高而增强；（3）dFV-ePD1融合蛋白对小鼠黑色素瘤细胞和人黑色素瘤组织芯片均有较高的结合活性；（5）融合蛋白dFV-ePD1 能抑制小鼠黑色素瘤细胞细胞迁移；（4）dFV-ePD1 融合蛋白能抑制小鼠黑色素瘤细胞的体外增殖和体内生长。 .结论：成功制备了基于抗明胶酶单链抗体和靶向PD-L1的双靶点特异性融合蛋白dFV-ePD1，该融合蛋白对小鼠黑色素瘤细胞具有很好的亲和力和体外增殖迁移抑制作用，具有用于临床抗肿瘤免疫治疗的潜在利用价值。