递进式强化新型维生素吡咯喹啉醌的生物合成途径

吡咯喹啉醌是新型维生素，在医药、食品及农业等领域具有广阔应用前景。首先用PCR法克隆肺炎克雷伯氏菌中的吡咯喹啉醌基因簇，构建载体后转化该菌本身，增加已有的代谢流量。基于RNA聚合酶sigma因子对基因组中启动子的广泛识别及亲疏差异性，用易错PCR法构建Sigma基因突变文库，转化肺炎克雷伯氏菌，然后筛选吡咯喹啉醌高产菌。为阐明高产机理，进行代谢流量和关键基因表达分析；并用抑制性消减杂交法分离差异表达基因，依照GenBank测序图谱将其进行染色体定位，从中获悉分布信息；同时利用KEGG数据库将编码酶的基因定位于代谢途径，确定影响产量的关键途径,并用数量遗传学方法评价关键途径对产量的贡献率，为后续的途径耦合奠定基础。本研究创新地提出了"递进式"强化生物合成途径的新思路，不仅获得吡咯喹啉醌高产菌，而且为其他大宗发酵菌种的催化途径改造奠定理论基础。

吡咯喹啉醌（PQQ）是多功能新型维生素。大肠杆菌不能合成PQQ，但肺炎克雷伯氏菌能合成PQQ，因为具有完整的PQQ基因簇。本研究克隆了大肠杆菌葡萄糖脱氢酶(GDH)基因gcd，构建了重组大肠杆菌BL21/pET28a-gcd。用IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明，该工程菌的GDH表达量约为对照菌的18倍。添加MgCl2能提高GDH的表达量。考虑到PQQ合成与启动子强度有关，将不同启动子整合至表达载体，发现卡那霉素抗性启动子最利于PQQ合成，而且肺炎克雷伯氏菌的PQQ产量高于大肠杆菌。为了消除代谢瓶颈，制备重组菌的细胞匀浆，与活体重组菌相比，无细胞体系的PQQ产量提高约30%，表明胞内存在PQQ合成的限速反应，而无细胞体系可解除此限速反应。为刺激PQQ分泌，构建了表达信号肽基因pelb的重组菌大肠杆菌，其PQQ产量达到40.73 mg/L，比对照菌E. coli BL21(pET-28a-pqq)提高了24.36%。此外，两株菌前3 h发酵的单位菌体产量及单位菌体产率均较高，此后且呈下降趋势。E. coli BL21(pET-28a-pelb-pqq)在21 h后的PQQ产量及生物量均增加，推测PQQ产量与菌体生物量之间存在协同关系。在大肠杆菌共表达GDH和PQQ基因，双质粒共存菌的PQQ产量高达199.8 mg/L，其葡萄糖利用率也明显提高。对肺炎克雷伯氏菌进行紫外和氯化锂诱变，前者所得菌株的PQQ产量较高。对一株产PQQ的假单胞杆菌的发酵条件进行了优化，通过单因素和正交试验，该菌在250 mL摇瓶的PQQ产量为448 mg/L，在1.5 L发酵罐的PQQ产量达 695 mg/L，这是目前报道未经优化或基因改造菌株的较高产量。总之，通过构建若干高产工程菌，该研究进一步阐明了PQQ合成机理，为将来工业生产奠定了基础。