黄瓜水苏糖合成酶基因选择性剪切在源库调节中的作用

In cucumber, stachyose synthase plays a key role in the regulation of assimilate partitioning between source and sink. Recently, three stachyose synthase mRNAs with the same ORF and the 5`untranslated region, but differing in their 3` untranslated regions, were identified in our lab. Southern blot and analysis of the cucumber genomic DNA sequence confirmed that these transcripts result from alternative splicing of a single gene. In this research, we will investigate the stability and translational efficiency of the 3 transcripts, and the effect of the specific sequences in the 3` untranslated region on the stability and translational efficiency. After that, three important “source-sink” change process in cucumber, i.e., the leaf-fruit ratio change, the diurnal variation of the assimilate output from source leaves, and the sink-source conversion during leaf development, were selected for observation of the expression levels of the 3 transcripts, the protein level, the enzyme activity, and the export capacity of the leaf. The results will elucidate the role of stachyose synthase gene alternative splicing in the source-sink regulation of cucumber. We also hope to find the relationship between the amount of 3 transcripts and the capacity of assimilate output of leaves, and use these date to evaluate the assimilate export potential of leaves. Finally, the results will provide useful clues for further research of assimilate partition of stachyose transporting plants and new plant adjustment technology of cucumber.

水苏糖合成酶是调节黄瓜同化物源库分配的关键酶。该基因在黄瓜基因组中只有一个拷贝，但在叶片中存在由选择性剪切形成的、5`非翻译区和编码区完全相同、3`非翻译区长度有差异的3种转录本。本项目拟首先研究3种转录本的稳定性和翻译效率，以及3`非翻译区特异序列对转录本稳定性和翻译效率的影响，探明底物产物与3种转录本产生的关系；在此基础上，针对黄瓜栽培中存在的3种重要源库变化过程，即叶果比例变化、同化物从源叶输出的昼夜变化以及叶片发育过程中的库源转换，观测上述源库变化中3种转录本的表达丰度、蛋白合成量、酶活性以及叶片同化物输出率的变化，研明该基因选择性剪切在黄瓜源库调节中的作用方式。同时，我们试图找到叶片中3种转录本表达总量及三者之间比例与同化物输出能力之间的关系，并希望这些数据可以作为衡量叶片功能的可信指标，为进一步研究水苏糖运输型植物的源库关系提供新方法，为制定科学的黄瓜植株调整策略提供新思路。

黄瓜（Cucumis sativus L.）以水苏糖作为同化物的主要运输形式，水苏糖合成酶(CsSTS)是调节黄瓜同化物源库分配的关键酶。该基因在黄瓜基因组中只有一个拷贝，但存在由选择性剪切形成的3种转录本。目前关于3种CsSTSs转录本的性能差异以及在黄瓜同化物装载中的调控作用尚不清楚。为此，本试验探明了3种转录本：受胞内糖水平调节表达的特点；稳定性和翻译效率；在黄瓜低温胁迫与解除过程中的表达变化；不同源库关系中的表达变化；反义RNA asCsSTS和miR2610对3种转录本表达的影响，以期为通过栽培手段调控黄瓜源库关系提供依据。结果如下：.（1）建立了“3碱基锚定引物”程序，可特异性鉴定3种CsSTSs。.（2）黄瓜愈伤组织转至无糖MS培养基后，3种CsSTSs的表达量上升；再转入含各种糖的MS培养基中，3种CsSTSs的表达量下降；表明CsSTSs的表达受细胞内糖水平的调节。.（3）3种转录本的稳定性：愈伤组织中CsSTS2显著低于其他2种转录本；幼苗期叶片中CsSTS3＞CsSTS2＞CsSTS1；成熟期叶片中CsSTS1＞CsSTS2＞CsSTS3。同时，3种CsSTSs的体外翻译效率并无差异。.（4）在低温胁迫下，黄瓜叶片中CsSTS1、CsSTS2的表达丰度显著高于CsSTS3，在低温胁迫中起主导作用。.（5）当植株上无果实时，3种转录本表达量较低；当植株保留一个果实时，果实所在节位的叶片中只有CsSTS1高表达，CsSTS2和CsSTS3的表达量几乎被抑制。.（6）miR2610在结果节位叶片中的表达显著高于非结果节位叶片，而CsSTS的反义RNA，asCsSTS在两类叶片中的相对表达高低则正好相反。asCsSTS主要在细胞质表达，表明其调控作用发生在转录后环节。黄瓜原生质体中过量表达或抑制试验表明miR2610和asCsSTS通过影响3种CsSTSs表达在黄瓜源库调节中发挥作用。.（7）5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-aza）处理黄瓜叶片能提高CsSTS1的表达量，表明5-aza能调控具有APA现象的基因。.（8）通过对黄瓜叶片进行APA测序分析，我们发现黄瓜叶片中发生APA现象的基因主要参与嘌呤代谢等途径。.上述结果为进一步研究水苏糖运输型植物的“源-库”关系提供新方法，为制定科学的黄瓜植株调整策略提供了新思路。