高盐和低温胁迫下玉米ZmMKK4基因功能分析及ZmMKK4-ZmMPK3/5级联途径的鉴定

选择玉米品种郑单958为材料，通过Northern 杂交和激酶试验分析高盐、低温、ABA及H2O2等信号分子对ZmMKK4、ZmMPK3、ZmMPK5基因的表达特性及激酶活性变化的影响。采用酵母双杂交、双分子荧光互补以及体内外激酶试验等方法，确定ZmMKK4与ZmMPK3、ZmMPK5的互作关系，鉴定一条完整的MAPK级联通路。通过转化拟南芥，分析过表达ZmMKK4基因植株在高盐、低温等胁迫下清除H2O2的能力，利用Northern 杂交及RT-PCR方法检测转ZmMKK4基因对H2O2合成酶类和清除酶类基因以及抗逆相关基因表达特性的影响，确定ZmMKK4基因的功能。利用Ubi-1启动子构建正义表达载体，基因枪轰击法转化玉米，通过杂交获得ZmMKK4、ZmMPK3、ZmMPK5三介转基因玉米，研究转基因玉米的抗逆生理特性，探讨ZmMKK4-ZmMPK3/5级联途径调控玉米抗逆性的分子机制。

本项目研究了玉米ZmMKK4基因的功能及抗逆生理特性。Northern杂交结果表明，ZmMKK4在玉米根、茎、叶中均有表达，在叶中表达量最高。低温、NaCl处理和外施H2O2均能诱导ZmMKK4的表达，而外施ABA抑制ZmMKK4的表达。过表达ZmMKK4基因提高了转基因植株的抗盐、抗低温及抗干旱的能力。干旱胁迫处理下，过表达ZmMKK4的转基因烟草的抗氧化能力得到改善。转基因烟草比野生型烟草细胞内源H2O2积累量少，氧化胁迫较轻；低温、高盐和干旱条件下，转基因植株相容性物质脯氨酸、可溶性糖的积累，以及抗氧化酶的活性明显高于野生型植株；高盐和低温胁迫下，过表达ZmMKK4的转基因拟南芥增强了内源AtMPK4的活性；低温、高盐和干旱条件下，过表达ZmMKK4的转基因植株增强了胁迫相关基因的表达。此外，我们运用生物信息学等手段鉴定出玉米中存在21个MAPK基因和9个MKK基因，同时运用酵母双杂交技术鉴定出4对MPK-MKK互作蛋白。