蓖麻矮秆相关基因的克隆与功能鉴定

本研究以蓖麻矮秆相关基因的分离研究作为切入点，在目前掌握的矮秆蓖麻种质资源和分子育种研究的基础上，根据其他植物矮秆相关基因的同源保守区域设计简并引物，然后利用3′RACE和5′RACE技术，获得蓖麻矮秆相关基因的全长序列；利用组织培养技术，建立蓖麻遗传转化体系；构建蓖麻矮秆基因重复表达载体，侵染生产中主推的高秆蓖麻品种的受体系统，获得转蓖麻矮秆基因的阳性植株，鉴定该基因的功能，为蓖麻育种提供新的种质资源。

1．根据Genbank（XM_002525863.1）公布的蓖麻细胞色素P450基因的碱基序列设计了两对引物，PCR扩增得到P450基因的两个片段，分别命名为P450s和P450a，与克隆载体成功连接后测序并进行序列比对，结果显示：P450s全长523bp，与原序列一致性为98.28%；P450a全长411 bp，与原序列一致性为99.51%，说明克隆的片段是蓖麻细胞色素P450基因片段。.2．构建了RNAi植物表达载体pBI-P450-RNAi。利用DNA冻融法将植物表达载体pBI-P450-RNAi成功转入农杆菌LBA4404，酶切和PCR检测正确，成功制备了用于侵染的农杆菌工程菌液。.3．建立了蓖麻品种“通篦5号”子叶节体外再生体系：子叶节最佳切取时间为子叶未从胚乳中抽出前，胚根和胚轴总长约为3-5cm时。去掉约2/3子叶和全部胚根的呈“箭头”状的子叶节一分为二竖直插入培养基中，筛选的最佳不定芽诱导培养基为1/8MS+8.0mg/L ZT，外植体再生芽频率为75.6%，每个外植体平均不定芽数为2.6个；最佳根分化培养基为1/8MS+2.0mg/L NAA，再生根频率为86.7%，且分化多条较粗壮的主根，每条主根上须根数量也较多，移栽后成活率较高。.4．建立了蓖麻子叶节遗传转化体系：按离体培养时的方式切取“通篦5号”子叶节，在1/8 MS+20 mg/L AS+8.0 mg/L ZT的培养基上预培养2-3d，然后在菌液浓度为OD600=0.8的农杆菌工程菌液LBA4404中侵染10min，共培养3d后转接到1/8 MS+250 mg/L Kan+300 mg/L Cef抗性筛选培养基上，大约40d左右完成了不定芽的分化和根的再生。再生小植株移栽成活后通过PCR和Southern blot检测证明为转基因阳性植株。.5．经Northern blot鉴定，RNA干扰的转基因蓖麻P450基因被抑制。转基因蓖麻叶片的过氧化物酶和酯酶同工酶比非转基因蓖麻少了1条谱带。转基因蓖麻表型变化特征为：株高明显降低，叶片变小，叶色加深。初步证明P450基因与蓖麻株高发育密切相关。Western blot蛋白分析结果表明，转基因蓖麻P450蛋白表达量比对照明显减少。