丁香糖丝菌中诺卡霉素（nocamycins）的生物合成研究

Nocamycins, belonged to tetramic acid compounds, were produced by actinomycete Saccharothrix syringae NRRL B-6468. Nocamycins have distinct structures and exhibit inhibitory activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria, especially potently against the anaerobic bacteria; however, the studies on the chemical total synthesis and biosynthetic machinery have not been carried out. In this study, we will investigate the biosynthetic machinery of nocamycins by using a combination of techniques such as microbiology, natural products chemistry, biochemistry and molecular biology. We will clone the nocamycin biosynthetic gene cluster and identify the distinct functional genes, then, the biosynthetic gene cluster will be disrupted and reprogrammed by using combinatorial biosynthesis method, leading to produce new nocamycin intermediates or analogues. These new compounds will be provided as chemical entities for the drug research and development. Meanwhile, we will characterize the functions of some essential enzymes in the biosynthetic process by biochemically assays with purified proteins in vitro, in order to elucidate the biosynthetic machinery of the structural units in nocamycins.

Nocamycins是由放线菌丁香糖丝菌产生的含2,4-二酮吡咯烷结构的化合物，其结构复杂独特，对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用，对厌氧菌的抑制效果尤为显著，而有关其化学全合成和生物合成的研究还尚未开展。本项目以nocamycins为研究分子，拟综合运用微生物学、天然产物化学、生物化学和分子生物学等多学科技能，对nocamycins的生物合成机制进行研究。通过克隆nocamycins生物合成基因簇，发掘其生物合成基因簇中与众不同的功能基因，对其中的关键功能基因进行阻断并运用组合生物合成的方法重新改造nocamycins的生物合成途径，产生新的nocamycins生物合成中间体或结构类似物，为新药的研究和开发提供化学实体和物质基础。同时，对生物合成基因簇中的一些关键酶进行体外蛋白表达和生化测试，阐明各结构单元的生物合成机制。

Nocamycins分离自放线菌Saccharothrix syringae的发酵产物，其对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用，对厌氧菌的抑制效果尤为显著。本研究从S. syringae中鉴定得到了nocamycin的生物合成基因簇，该基因簇全长约61kb，包含21个开放阅读框。整个基因簇包括5个聚酮合成酶基因（ncmAI, ncmAII, ncmAIII、ncmAIV和ncmAV），1个非核糖体肽合成酶基因ncmB，1个Dieckmann环化酶基因ncmC， 7个与调节和抗性相关基因ncmM，ncmN，ncmH，ncmI，ncmK、 ncmJ、ncmQ，6个与后修饰相关的基因，包括两个细胞色素P450氧化酶基因ncmG 和ncmO，1个短链脱氢酶基因ncmD，1个糖基水解酶基因ncmE，1个甲基转移酶基因ncmP和1个FAD依赖的脱氢酶基因ncmL，另外，还存在1个功能未知的基因ncmF。. 通过基因敲除的方法研究了基因ncmB、ncmO、ncmG、ncmD、ncmE、 ncmL、NcmP、ncmN和ncmJ在nocamycin生物合成中的作用。NcmO和NcmP缺失的突变株不能够生产nocamycin类化合物。NcmG缺失的突变株新生产了两个新的nocamycin衍生物nocamycin III 和nocamycin IV。NcmE缺失突变株中产生一个新的极性更大的nocamycin中间体化合物。NcmD缺失突变株虽然能够生产nocamycin I 和nocamycin II，但同时有两个新的衍生物的形成。NcmN和NcmJ编码的调控蛋白在nocamycin生物合成过程中起着正调控子的作用。对NcmC的同源蛋白TrdC和SlgL在nocamycin类化合物的生物合成中的功能进行了深入的研究。通过生物信息学结合体外催化反应证实了NcmC类同源蛋白是一类新颖的Dieckmann环化酶，其在nocamycin类化合物生物合成过程中催化tetramic acid结构的形成。. 综上所述，本研究确定了nocamycins的生物合成基因簇，同时也对部分基因在生物合成过程中的功能进行了研究。这为利用生物合成方法和组合生物合成方法重新改造nocamycins的生物合成途径，产生新的nocamycins生物合成中间体或结构类似物奠定了基础。