大豆耐旱性相关的miRNA鉴定与功能分析

干旱胁迫已成为限制大豆产量及品质的主要因素，对干旱胁迫下miRNA进行系统鉴定和功能分析将有助于深入了解大豆抗旱性的分子本质。本研究在构建大豆小RNA文库的基础上，利用高通量深度测序和生物信息学技术获取大豆候选miRNA及其靶基因，并制备miRNA芯片，筛选在干旱胁迫条件下差异表达的miRNA；同时利用大豆基因芯片对抗性相关基因的时空变化开展研究；运用实时荧光定量PCR（QRT-PCR）技术，鉴定所筛选的大豆miRNA、靶基因及抗性相关基因；最后，结合生理指标、酶活性测定结果，分析miRNA与抗性相关基因的内在联系，揭示miRNA调控的耐干旱分子机理，从本质上为大豆耐旱机理研究奠定理论基础。

微小RNA（MicroRNA，miRNA）在植物生长发育和抗逆境胁迫方面具有重要的调控作用。干旱胁迫限制了大豆产量及品质的主要因素，对干旱胁迫下miRNA进行系统鉴定和分析将有助于深入了解大豆抗旱性的分子本质。本项目以大豆叶片、茎、根为材料，构建大豆混合小RNA文库1个，经高通量测序后获得非冗余小RNA序列52,305条。经生物信息学比对与结构预测，共鉴定118条已知miRNA和18条新miRNA。同时，为进一步进行实验学验证，我们通过Ploy(A)加尾法结合以U6作为阳性参考基因，建立了大豆miRNA qRT-PCR检测方法。为了更深入理解大豆miRNA的作用机制，本项目组通过生物信息学预测和降解组测序两种方法进行靶基因鉴定，共获得96个靶基因；同时，我们开展靶基因切割位点分析，根据靶基因切割位点信号强度，将靶基因分成4类。经GO和KOG分析，我们认为miRNA通过与靶基因互作，在大豆植株生长发育、抵御外界胁迫等方面起重要调控作用。为进一步开展干旱胁迫下大豆抗性机理分析，我们构建了1个大豆微核心种质库。结合核心种质表型鉴定与分子遗传背景分析，我们将种质材料分为两个大类，并从中选择干旱敏感型和抗旱型材料各1份，用于miRNA差异表达及生理表型鉴定。通过对干旱胁迫下不同抗性大豆品种miRNA表达分析，共鉴定19条差异表达的miRNA；在此基础上通过降解组分析及qRT-PCR技术鉴定相应miRNA的靶基因表达模式，联合抗氧化酶表型生理指标，初步推测miR398、miR159等miRNA家族介导的酶活性、转录因子表达上调是大豆耐旱品种获得抗性的重要分子机制之一。.