兜兰花器官发育相关MADS-box基因克隆及功能分析

The orchids are of unprecedented diversity, uniuque floral morphlogy, rich colors and long flowering, have high ornamental value. The flowers of Paphiopedilum are unique, the outer whorl has three sepals and the inner whorl has three petals. The sepals are usually very similar to the petals (and thus called tepals). The under medial petal, called the labellum or lip , is a highly modified and enlarged structure, is considered to be a unique innovation during the orchid evolution. At present, the research about molecular mechanism of orchid flower formation is only a few, especially about the special hood lip, it has never been reported. Paphiopedilum armeniacum is our country unique species, has bright yellow color, and has received the hightest prize in the international flower show, has important ecomomic value. We aim at revealing the molecular mechanisms of the Paphiopedilum flower formation. We will clone the flower identity MADS-box genes, analyze gene structures, phylogeny, gene duplication and gene expression pattern, to eliminate the molecular mechanism basics of the flower formation and the correlation between the gene duplication genes and the origin unique innovational lip. This work provide a conceptual and experimental frame work for better understanding of the molecular genetic basis of orchid perianth research, and provide basis for its genetic improvement.

兰花是兰科植物的统称，其种类繁多、花型奇特、色彩丰富且花期较长，具有极高的观赏价值。兜兰属植物的花具有相当独特的花部形态，由外向内分别为萼片、花瓣和合蕊柱，部分兰花的萼片和花瓣性状极为相似，合称为花被片，其中一个花瓣高度特化形成兜状唇瓣，这是兰花进化过程中形成的独特的创新性状。目前，对兰花花形态建成的分子机制的研究较少，特别是关于兜兰兜状唇瓣的形成的分子机制还未见报导。杏黄兜兰是我国特有的兜兰原生种，其花朵金黄，一经面世就多次获得国际花展和兰展的最高奖，具有极高的经济价值。本研究拟通过对杏黄兜兰花发育相关MADS-box基因的克隆，进行基因的结构分析，系统发育分析，基因重复分析，以及基因的表达式样分析，探究兜兰花发育的分子机理，基因重复和创新性状兜状唇瓣的相关性，为进行兜兰花型或花期的遗传改良奠定基础，并为兰花花被片进化发育研究提供理论基础。

MADS-box基因是调控植物花器官发育的关键基因，而目前对兜兰的MADS-box基因的研究很少。为了解B类MADS-box基因在兜兰属植物中的表达情况，我们采用RACE技术从亨利兜兰（P. henryanum）中克隆了5个与花器官发育相关的B类MADS-box基因进行序列分析；利用实时荧光定量PCR的方法对它们的表达模式进行分析。主要结果如下：.克隆到的5个B类MADS-box基因，分别命名为PahePI、PaheAP3A1、PaheAP3A2、PaheAP3B1、PaheAP3B2。序列分析表明：它们均含有高度保守的MADS盒、较为保守的K盒、中度保守的I结构域和特异的C末端。蛋白同源性分析显示：5个B类基因与兜兰属植物同分支上基因蛋白序列一致性达90%以上。系统发育分析表明：PI类基因在兰亚科（Orchidoideae）中发生基因复增事件形成PI-1和PI-2分支，而在杓兰亚科（Cypripedioideae）和树兰亚科（Epidendroideae）中可能丢失了PI-1，PahePI聚在了PI-2分支上；PaheAP3A1、PaheAP3A2、PaheAP3B1、PaheAP3B2分别聚在了paloAP3进化枝的4个分支上。.5个B类MADS-box基因在不同发育阶段的花芽和不同器官中的表达模式既存在着与其他植物同源基因相似的保守性，也具有自身的特异性。5个基因在根、花茎、叶中表达量都很低。在不同发育阶段的花芽中均有表达，并且表达丰度要普遍高于其在各器官中的表达量。PahePI在花器官各组织中均有表达，且表达量差异不大。AP3类基因在花器官不同部位的表达模式各不相同：PaheAP3A1基因在唇瓣中高度表达，在合蕊柱中的表达量也较高，花瓣中的表达量次之，在萼片中几乎不表达；PaheAP3A2在各轮花器官中由外向内表达量有逐渐上升的趋势，在子房中的表达量最高；PaheAP3B1只在合蕊柱中有较高的表达量；PaheAP3B2在萼片和花瓣中高度表达。B类基因不仅在第2、3轮花器官中表达，而且在萼片、子房中也有表达，这说明B类基因的功能可能发生了延伸，对瓣状萼片、子房的发育发挥一定的作用。这将为探究兜兰花发育相关的B类MADS-box基因的功能和分子机理奠定基础。