基于微流控和微液滴技术的卵细胞玻璃化冻存研究

Oocyte Cryopreservation offers a novel option to female cancer patients for their fertility preservation. However, the technology used for oocyte cryopreservation is not well established, thus can not be used as a standard procedure in assisted reproduction clinics, and still in the experimental stage. The goal of this project is to develop a high throughput and automated microdroplet generation system, which could be applied for nanoliter volume vitrification of oocytes. This will facilitate the increase of heating rates during vitrification and warming, thus reducing the CPA concentration as well as the chemical toxicity and osmotic shock to the cells. In the meantime, we will also develop a microfluidc system to achieve a continuous CPA gradient during addition and removal, thus reducing the cell damage caused by sudden change of CPA concentration between the cell membrane. Furthermore, we will integrate the two system, and use for oocyte cryopreservation. The viablity, microstructure and reproductive function of the oocytes retrieved after vitrification and warming will be evaluated, and compared to conventional oocyte vitrification method as well as fresh oocytes. We expect that the innovative technologies developed in this project will minimize the cryoinjury and improve the efficiency of oocyte cryopreservation. The advances in this project will be have great impacts on various fields including reproductive medicine, biomedical engineering, cryobiology and regenerative medicine.

冷冻保存卵细胞为女性癌症患者生殖能力的保存提供了一种全新的选择。但是人卵细胞冻存技术尚不成熟，无法满足辅助生殖临床的要求，仍定位为实验研究性质。本项目拟构建一个基于微液滴的高通量、自动发生系统，用以实现卵细胞“纳升体积”微液滴玻璃化冻存，通过提高冷冻复苏过程中的降温和升温速率，降低所需CPA浓度以减少对细胞产生的化学毒性和渗透性休克效应。同时，本项目还将构建一个微流控芯片系统，用于实现CPA 连续浓度梯度导入和洗脱，以降低由于细胞膜内外浓度突变对细胞造成的损伤。最终将微流控芯片和“纳升”液滴发生系统整合，用于卵细胞的玻璃化冻存研究。对比新鲜卵细胞，对冷冻复苏后卵细胞的活性、微观结构和生殖功能等进行考察，并与传统玻璃化冻存方法相比较。期望通过技术创新来降低冻存过程对卵细胞造成的损伤，以提高卵细胞冻存效率。本研究的成功开展将在生殖医学、生物医学、冷冻生物学、再生医学等领域显示广阔的应用前景。

卵细胞冻存为女性生殖能力的保存提供了重要手段。但由于目前的冻存技术尚不成熟，在临床仍被定位为实验研究。基于液滴的玻璃化冻存技术由于避免了载体造成的热阻，可显著提高卵细胞冷冻和复苏过程中的热传递速率，有助于卵细胞冻存在生殖医学领域的发展。但是，在基于液滴的玻璃化冻存过程中，由于Leidenfrost效应的存在使得液滴无法快速通过结晶温度区，影响了液滴的降温速率且产生大量冰晶，降低了玻璃化冻存的效率。此外，Leidenfrost效应引起的液滴无规则运动还会使得液滴收集困难，大量细胞损失在冷冻过程中。基于此，我们对微液滴冷冻过程中的Leidenfrost效应进行研究，并提出借助磁性纳米颗粒对该效应的克服方法，并对其进行了验证。最后通过卵细胞的冷冻保存对该方法进行验证。围绕该项目的研究目标完成了以下四个方面的工作：.（1）搭建了基于微液滴的自动化、高通量的卵细胞玻璃化冻存发生系统，研究微液滴制备条件对液滴大小和分布的影响并获得适于卵细胞冻存微液滴尺寸； .（2）研发非接触式的液滴玻璃化冻存装置，避免Leidenfrost效应对液滴玻璃化冻存的影响。利用该系统冻存的NIH/3T3纤维细胞和人类脂肪源性干细胞（hASC）均保持了较高的活力，冻存后干细胞保持了较高的分化潜能；.（3）利用Fe3O4磁性纳米颗粒操控液滴进入液氮的速度，克服微液滴玻璃化冻存过程中的Leidenfrost效应，从而解决了因Leidenfrost效应导致的液滴结晶和难收集等问题，并从物理模型和实验两方面验证了磁性纳米颗粒对Leidenfrost效应克服的原理和效果。.（4）最后将基于磁性纳米颗粒的液滴玻璃化冻存方法用于卵细胞的冷冻保存，与未使用磁性纳米颗粒的液滴玻璃化冻存方法相比，获得的解冻后卵细胞存活率提高了2倍以上。. 本项目首次提出利用磁性纳米颗粒克服Leidenfrost效应的方法，为冷冻生物学领域使用微液滴进行细胞冷冻保存提供了有效的手段。这一研究成果对于提高卵细胞冻存效率具有重大应用价值，此方法对冻存胰岛等大体积细胞及微组织也显示出极大的潜力。