J亚型禽白血病病毒诱导鸡CD4+T细胞特异性应答反应机制

Avian Leukosis Subgroup J (ALV-J) is prevalent among various breeds of chickens in our country and causing huge harm. However, there is no thoroughly study on the mechanism of anti-ALV-J immune response. Especially, the study on ALV-J specific CD4+T cell immune response is still vacancy up to now. This project intends to establish the ALV-J antigen specific CD4+T cell line in vitro, then to observe their effector productions directing at ALV-J single antigen response, and to explore their potential effect in the anti-ALV-J infection immunity. Overlapping synthetic peptides will be used to identify the immunodominant epitopes of ALV-J immunodominant antigen. Then, the frequencies of epitope specific CD4+T cell would be verified in ex vivo. This project would elucidate the mechanism of the resistance difference among MHC-B haplotype restricted chicken lines to ALV-J, via analyzing the MHC restriction of immunodominant epitopes, and Th1 or Th2 phenotype of ALV-J and epitope specific CD4+ T cell. The research results would expound the immunodominant epitopes and phenotype of ALV-J specific CD4+ T cell response, and then uncover the mechanism of ALV-J-induced chicken CD4+T cell specific immune response. It would provide some data and theories support for making ALV-J control measures and breeding resistance varieties.

J亚型禽白血病病毒（ALV-J）在我国鸡群中普遍流行，造成的危害巨大。然而，抗ALV-J感染免疫应答机制一直都没有得到系统而深入的研究，尤其是ALV-J特异性CD4+T细胞免疫应答研究尚属空白。本项目拟在体外建立ALV-J全抗原特异性CD4+T细胞系，观察其对ALV-J单个病毒蛋白抗原应答的效应分子表达情况，阐明其在抗ALV-J感染免疫中的作用。采用步移重叠合成肽的方法，对ALV-J优势应答蛋白的优势表位进行筛选和鉴定，并在离体水平验证免疫优势应答谱。通过研究优势表位的MHC限制性，及ALV-J和表位特异性CD4+T细胞Th1和Th2类效应因子表型；揭示MHC-B单倍型SPF鸡对ALV-J抗性差异机制。本项目将明确ALV-J特异性CD4+T细胞免疫优势表位及表型，揭示ALV-J诱导鸡CD4+T细胞特异性应答反应机制，为建立有效的ALV-J防控技术和培育抗性品种提供数据和理论支持。

J亚型禽白血病病毒（ALV-J）在我国鸡群中普遍流行，造成的危害巨大。然而，ALV-J感染诱导适应性免疫应答研究却十分匮乏。本项目研究发现体液免疫应答产生的抗体可能并不是抵抗ALV-J感染的关键或必需要素，而鸡细胞毒性T细胞免疫应答对ALV-J感染清除发挥了重要作用。ALV-J感染SPF鸡后诱导外周血淋巴细胞中CD8+单阳性T细胞比例显著上调，CD4+单阳性T细胞和CD4+CD8+双阳性T细胞比例没有明显变化。此外，我们发现感染组鸡从21DPI开始出现了一群CD8high+T细胞，CD8+T细胞进而形成了稳定的3群细胞包括CD8high+, CD8medium+和 CD4+CD8low+T细胞群；几乎所有的CD4+CD8low+T细胞群属于CD4CD8αα表型。与此相反地是，大部分CD8high+和 CD8medium+T细胞群是CD8αβ表型。我们发现CD8high+T细胞活化可能产生效应细胞因子granzyme K, NK lysin和IFN-γ清除ALV-J感染。通过流式分选和smart-seq2单细胞测序技术比较分析ALV-J感染后CD4+CD8+T双阳性细胞与CD8+单阳性T细胞的潜在功能和基因表达谱的差异发现，CD4+CD8+ T细胞高表达调节性Treg细胞的转录因子和负调控T细胞活性的基因包括CCND1, ROCK1, FOXO1, FOXO3, TNFRSF18和TNFRSF21，因此可能发挥负调控T细胞活性的功能。与此相反地是，CD8+单阳性T细胞高表达Granzyme K、Granzyme A 和CCL5等T细胞活化应答基因。通过10xscRNAseq单细胞测序技术分析鸡外周血单个核细胞（PBMC）对ALV-J感染的应答反应，发现CD4+T细胞可能分化为细胞毒性Th1-like细胞，并对ALV-J的感染清除发挥重要作用。此外，我们通过比较ALV-J感染对不同单倍型SPF鸡（B2、B15和B19单倍型SPF鸡）致病性差异，发现B2单倍型SPF鸡对ALV-J感染具有潜在抗性，并与细胞毒性T细胞活化应答相关。最后，我们通过ELISpot试验鉴定了三条ALV-J MHC-B2限制性T细胞表位肽。以上研究结果初步揭示了ALV-J诱导T细胞免应答机理，为建立有效的ALV-J防控技术和培育抗性品种提供数据和理论支持。