腺苷酸环化酶在细胞纤毛生长和器官形态发育中的调控机制研究

Cilium, a microtubule-based organelle that projects from the cell surface, has crucial roles in embryonic development, organ morphogenesis, cell signaling transduction and human physiology. We have recently identified that Prostaglandin E2(PGE2) signaling acts through a ciliary G-protein-coupled receptor, EP4, to promote ciliogenesis and regulate the laterality of visceral organs（Nature Cell Biology, 2014). PGE2-EP4 receptor signaling activates downstream cAMP/PKA signal through adenylate cyclase (AC). The AC family consists of 9 isoforms. It remain incompletely understood which AC isoforms are involved in ciliogenesis and left-right asymmetry and how AC plays essential roles in ciliogenesis. Based on the previous studies, we will determine the roles and mechanisms of AC isoforms in cilium formation and elongation. We will also investigate the effects of cAMP/PKA signaling during ciliogenesis. We hope the findings of this proposal will provide new insights into mechanisms of ciliogenesis and organ morphogenesis during development.

纤毛是以微管为基础形成的突出于细胞表面的细胞器，在胚胎发育、器官形成、细胞信号转导及人体生理功能维持等方面发挥着关键作用。我们最新研究发现前列腺素E2(PGE2)通过作用于纤毛定位的G蛋白偶联受体EP4调控纤毛生长和内脏器官左右不对称发育 (Nature Cell Biology, 2014)。PGE2-EP4信号主要通过腺苷酸环化酶(adenylate cyclase, AC) 激活下游cAMP/PKA信号。AC共有9种亚型，在调控纤毛生长和决定器官不对称发育中有哪些AC亚型参与，cAMP/PKA在其中是否具有作用仍不十分清楚。我们将基于前期研究成果，以斑马鱼和人类纤毛细胞为模型，筛选并确定PGE2-EP4信号在调控纤毛生长中的重要AC亚型，解析其定位于纤毛的特殊功能。同时，进一步探讨cAMP/PKA信号对纤毛生长的调控作用和机理。期望该研究能在纤毛与器官发育机制方面有所突破。

我们前期发现前列腺素E2(PGE2)通过作用于纤毛定位的G蛋白偶联受体EP4，激活腺苷酸环化酶(adenylate cyclase, AC)及下游的信号，调控纤毛生长和内脏器官左右不对称发育，但哪些AC酶参与其中仍不十分清楚。我们以斑马鱼为模式动物，筛选了全部12种腺苷酸环化酶的亚细胞定位，确定仅有AC3a,AC5,AC6b定位于纤毛。我们利用CRISPR/Cas9技术构建了AC3a-/-,AC5-/-及AC3a-/-,AC5-/-双突变体，没有发现这些突变体具有纤毛生长缺陷及纤毛异常相关表型，但令人意外的是，AC5-/-单突变胚胎及成鱼的黑色素明显减少， AC3a-/- AC5-/-双纯合突变体的黑色素缺陷更加明显。然而，AC6a-/-,AC6b-/-单突变及AC6a-/- AC6b-/-双突变体的黑色素基本正常。该结果提示纤毛及纤毛定位的AC酶在调控黑色素合成中可能起了关键作用。. 尽管前列腺素E2调控纤毛的生长，但对于视网膜纤毛及感光细胞的发育影响仍不清楚。我们从前列腺素E2的合成、转运和信号接收三个方面来研究其在视网膜感光细胞及其连接纤毛发育中的作用。证实了斑马鱼前列腺素合成酶COX/PTGES缺陷、转运出胞蛋白ABCC4缺陷及PGE2受体EP4C/PTGER4C缺陷都能引起斑马鱼感光细胞连接纤毛和外节完全缺失，感光色素错误定位在胞体中，最终导致感光细胞发育异常及退化。. 中心体作为动物细胞内主要的微管组织中心，在纤毛发生及生长中起关键作用。我们运用CRISPR/Cas9基因编辑系统对斑马鱼中心体蛋白Tubgcp3进行了敲除。尽管Tubgcp3缺陷没有引起纤毛发生及生长异常，但Tubgcp3蛋白缺失引起斑马鱼胚胎眼睛睫状边缘带（ciliary marginal zone，CMZ）中视网膜前体细胞有丝分裂阻滞和凋亡，造成Tubgcp3突变体小眼缺陷。