P-TEFb重活化调控机制及其对细胞周期的影响

P-TEFb是调控真核基因转录延伸的核心转录因子，与艾滋病、心肌肥大和肿瘤均有密切关系，但有关P-TEFb的细胞生物学功能作用机制仍不了解。在细胞内，P-TEFb主要以无活性和可被募集两种复合体存在。我们新近的研究发现细胞外刺激通过激活PP2B和PP1信号途径，协同使P-TEFb去磷酸化而将P-TEFb从无活性复合体中释放出来；并证明该去磷酸化作用也是P-TEFb与核蛋白Brd4结合并被募集到基因启动子上的前提条件。由于去磷酸化的P-TEFb尚须在募集后被重活化才具有功能，我们推测这种调控方式可能与P-TEFb的细胞生物学功能有密切关系。为此，我们拟在前期基础上，鉴定与P-TEFb重活化相关的激酶，揭示P-TEFb的重活化机制，阐释P-TEFb在基因启动子上募集的机制，并探讨P-TEFb的重活化与调控细胞启动G1期进程的相关性。为阐明P-TEFb的细胞生物学功能提供科学依据。

近年研究显示，基因转录延伸也是调节基因快速表达的重要环节，由于正性转录延伸因子P-TEFb是调节该环节的关键因子，因此该环节的调节，实质上是由P-TEFb自身活性及其在基因启动子区募集的调控所调节。本项目主要研究内容，是阐明P-TEFb重活化及其在基因启动子区募集的分子机制。为此，我们首先建立了细胞核分级分离技术，发现P-TEFb的核心募集因子---Brd4蛋白也存在应激活化现象。在未刺激细胞内，Brd4均与染色质结合；细胞受激后，Brd4则可从染色质解离，与P-TEFb结合而将其募集到染色质上，从而调控基因转录延伸（已发表于Nucleic Acids Res）。后继研究进一步发现PP1a和HDAC1/2/3双信号途径介导调控Brd4应激活化，并阐明组蛋白H3S10ph和H4K5ac/K8ac之间的Corrstalk，是衔接双信号途径、调控Brd4应激活化的分子机制（论文已投Mol Cell Biol，正在审稿）。.我们早期研究显示：P-TEFb/Cdk9-T186ph去磷酸化，是P-TEFb从无活性复合体中释放出来的必要条件，但Cdk9-t186ph去磷酸化也导致Cdk9丧失激酶活性。采用分级分离技术，我们发现Cdk9-T186ph去磷酸化还可导致Cdk9与调节亚基CyclinT1解离，解离后的Cdk9单体，可分别与Brd4和另一个募集因子AFF4相互作用，且该相互作用可诱导Cdk9-T186自磷酸化，也是Cdk9与其调节亚基CyclinT1重新结合、形成功能P-TEFb的前提条件；有意思的是，Brd4和AFF4可分别将P-TEFb募集到位于基因启动子区Mediator的不同modula上，并分别磷酸化DSIF和NELF，从而以“双保险”方式解除这些因子对转录延伸的抑制作用，导致延伸重启，表明延伸重启是被严格调控的过程。那么，Brd4或AFF4又是如何识别哪些基因需要进行延伸重启？为此，我们以NF-kB依赖性基因转录为模型进行研究，结果显示：当NF-kB被活化而转位到细胞核后，与应激活化的Brd4相互作用，并将Brd4/P-TEFb募集到NF-kB依赖性基因启动子区，从而调控基因转录延伸的重启（论文在写作中）。因此，本项目研究不仅阐明了P-TEFb重活化及其募集的分子调控机制，也意外发现了调控转录延伸重启的重要机制，为后继研究奠定了扎实的基础。