纳米载体提升昆虫RNAi效率的作用机理研究

As a practical analysis tool, the RNAi technology promotes the identification of gene function and the development of epigenetics related areas. However, the RNAi effect is limited in some insects. Thus, we previously constructed a nanocarrier mediated RNAi system, achieving a high gene silencing efficiency. The functional mechanism of nanocarrier mediated RNAi is not clear. In the current project, the functional mechanism of nanocarrier mediated RNAi will be revealed. The morphology, partical size and thermodynamic parameter of nanocarrier/dsRNA complex will be investigated after the RNA degeneration enzyme treatment, revealing the degradation degree of dsRNA. The complex mediated key factors in cells will be selected, and the key genes and proteins related with the RNAi efficiency will be analyzed. The method to elevate the nanocarrier mediated RNAi efficiency will be investigated by regulating the gene expression related with the RNAi efficiency. Our project will illustrate the process from the combination of nanocarrier and dsRNA to the function of nanocarrier to promote the RNAi. The smooth implementation of this project will not only help to illustrate the functional mechanism of nanocarrier mediated RNAi to provide an efficient and simple tool for the massive gene functional analysis, but also offer the technological reserve for the development of RNA pesticides based on nanocarrier, which will promote the practice and development of RNAi-based pest management.

作为一种实用的分析工具，RNAi促进了基因功能解析及表观遗传学相关领域的发展，但一些昆虫的RNAi效果有限，申请人所在团队建立了纳米载体介导的RNAi技术，可以大幅提升基因干扰效率，但其作用机制尚不明确。本项目将开展纳米载体介导的RNAi作用机理的研究，明确RNA降解酶处理前后纳米载体/dsRNA复合体在形貌、粒径、热力学参数上的变化，揭示dsRNA的降解程度；筛选纳米载体/dsRNA复合体介导的细胞内关键因子，分析响应RNAi效率相关的关键基因和蛋白；通过调控与RNAi效率相关基因的表达，探讨提升纳米载体介导的RNAi效率的方法。本项目的顺利开展将阐明纳米载体从结合dsRNA到促进其发挥作用的全过程，不仅有助于阐释纳米载体介导的RNAi作用原理，为大规模基因功能解析提供一种高效简便的实用工具，还将为借助纳米载体研发RNA农药提供技术储备，有利于促进RNAi害虫控制策略的实践与发展。

近20年来，RNAi广泛应用于昆虫基因的功能解析，为阐明复杂生命活动提供了一种实用的分析工具。但昆虫肠道和血淋巴中的RNA酶会导致外源dsRNA的降解；同时，一些小个体昆虫的显微注射技术要求高，机械损伤大。因此，一些鳞翅目和半翅目昆虫的RNAi效率低、稳定性差、实操性差，制约了关键基因的功能解析。本项目建立了一种纳米载体介导的dsRNA体壁递送系统，高效运载dsRNA穿透蚜虫体壁，实现害虫靶标基因的高效干扰，起到了良好的害虫控制效果，但纳米载体介导的细胞内增效机制尚不明确。本项目阐明了纳米载体介导的RNAi作用机理，纳米载体可以大幅提升dsRNA的稳定性，激活网格蛋白介导的胞吞作用，进而增强dsRNA的摄入，提升RNAi效率。同时，本项目建立了一种新型大肠杆菌表达dsRNA系统，约是目前常用的L4440-HT115(DE3)大肠杆菌表达系统的3倍，在低成本的基础上实现了dsRNA的高效生产。为进一步开发可喷洒型RNA农药，本项目首次将纳米递送系统与大肠杆菌表达系统有机融合，通过构建新型RNA干扰载体，实现了双靶标基因hpRNA的同时表达，并结合纳米载体SPc制备RNA喷雾剂，对温室桃蚜起到了良好的防治效果，综合防效达60%。为进一步提升RNA制剂对桃蚜的防效，本项目建立了可同时装载dsRNA和植物源农药的纳米递送系统，成功制备了一种可克服RNA农药持效期短、植物源农药速效性差的多元纳米生物制剂，田间综合防效高达90%以上。在本项目的资助下，项目主持人于Journal of Nanobiotechnology (IF5y=11.509，ESI高倍引论文)、Journal of Pest Science (IF5y=5.563，ESI高倍引论文)、BioTechniques (IF5y=2.526)、植物保护学报发表第一标注论文4篇，于Nano Today (IF5y=20.24，ESI高倍引论文)、Insect Science (2篇，IF5y=3.323，ESI高倍引论文)、植物保护学报、中国植保导刊发表第二标注论文5篇，于Journal of Pest Science (IF5y=5.563，ESI高倍引论文)、Pest Management Science (IF5y=4.689)发表第三标注论文2篇，以第一标注编写专著一章，授权发明专利一项。