R-spondin蛋白对缺血性脑卒中后血脑屏障功能的调控作用和分子机制

Currently the most effective therapy of ischemic stroke is to remove the thrombus, reopen the artery, and reperfuse the ischemic region. However, ischemia/reperfusion causes vascular injury and induces blood-brain barrier (BBB) breakdown, which further damages neural tissue and increases risks of hemorrhage. How ischemia/reperfusion injury induces blood-brain barrier breakdown remains unclear. Previously we have found the Wnt/beta-catenin signaling pathway in the cerebrovasculature plays an essential role in regulating BBB integrity following ischemic stroke, however, the role of R-spondin, an important regulator of the Wnt/beta-catenin signaling pathway, has been unknown in this process. In this proposal, we plan to use adenovirus and combine approaches of cellular and molecular biology, transcriptomics and genetics to identify the role and underlying mechanism of R-spondin in the regulation of BBB function in mouse ischemic stroke model. We aim to: 1) assess the effects of R-spondin on BBB function and neural tissue injury following ischemic stroke; 2) identify the downstream signaling pathways and BBB function-related genes that R-spondin regulates in brain endothelial cells; 3) determine the key signaling molecules in R-spondin-mediated BBB regulation. The proposed project will shed lights for the mechanisms of brain ischemia/reperfusion injury and aid the development of novel therapies for ischemic stroke.

缺血性脑卒中目前的治疗手段是疏通血管，使缺血区域再灌注，但这也会造成急性血管损伤，破坏血脑屏障结构与功能，增加脑出血的风险。目前缺血再灌注损伤导致血脑屏障功能破坏的分子机制尚不清楚。申请人在前期工作中揭示脑血管内皮细胞Wnt/beta-catenin信号通路对缺血性脑卒中后血脑屏障功能有重要调节作用，但是Wnt/beta-catenin信号通路的重要调节蛋白R-spondin在其中的作用尚不清楚。本项目拟利用腺病毒、细胞生物学、转录组学和遗传学等方法深入研究R-spondin对小鼠缺血性脑卒中后血脑屏障功能的作用和机制。本项目将：1）探寻R-spondin对缺血性脑卒中后血脑屏障功能以及脑损伤的调控作用；2）确定R-spondin在脑血管内皮细胞中调控的信号通路及血脑屏障功能基因；3）鉴定R-spondin调控血脑屏障功能的关键信号传导分子。本项目将为缺血性脑卒中的治疗提供新的思路和手段。

项目负责人在前期研究中发现，脑卒中发病后Wnt/β-catenin信号通路对血脑屏障的功能维持至关重要。增强 Wnt/β-catenin信号通路活性可以减轻脑卒中后⾎脑屏障功能的受损，减⼩脑梗死体积并改善神经功能障碍。但由于Wnt蛋白的天然结构具有疏水性，且该结构与其生物活性直接相关，因而无法被制备成为注射剂并用于脑卒中的治疗。本项目聚焦研究了人体的内源性蛋白R-spondins (RSPOs)。RSPOs在成年小鼠大脑中广泛表达，并在缺血和再灌注损伤时上调。外源性补充RSPOs能够强有力地增强脑血管内皮细胞中的Wnt信号活性，并发挥血脑屏障的保护作用及神经保护作用。在过去4年的项目执行期内，本课题研究始终围绕既定科学目标，按照预定研究方案持续推进。到目前为止，我们已经全面实现了项目预期目标，主要研究发现如下：（1）在脑卒中发生后，内源性RSPOs中Rspo1、Rspo3和Rspo4的转录水平在大脑皮层显著上调，而Rspo2和Rspo3主要是在纹状体中上调。这种上调是具有神经保护作用的，抑制RSPOs与受体结合会显著加重脑卒中对小鼠脑组织的损伤。而外源性补充RSPOs则具有显著的治疗作用。（2）RSPO1对卒中小鼠的治疗作用是依赖于对小鼠脑内的Wnt信号通路的激活实现的。通过抑制Wnt信号通路活性，可以完全废除RSPO1对脑卒中小鼠的治疗作用。（3）小鼠脑血管内皮细胞中表达了RSPOs的受体LGR4，RSPO1蛋白通过LGR4增强脑血管内皮细胞Wnt信号通路，保护卒中后受损的血脑屏障功能，从而发挥治疗作用。综上，本项目阐明了缺血性脑卒中的一种新的治疗思路，即通过RSPOs蛋白激活Wnt/β-catenin信号通路，保护脑缺血再灌注后受损的血脑屏障功能，进而发挥治疗作用。本项目研究结果拓展了脑卒中的病理机制以及治疗方法，同时也为脑卒中治疗药物的研发提供了新的靶点和设计思路。