Ambra1基因在肌醇缺乏状态下对胚胎神经管发育中自噬的调控机制

Inositol deficiency is one of the risk factor of neural tube defects (NTDs). Autophagy plays an important role in neural tube development. Autophagy and beclin 1 regulator 1 (Ambra1) gene is a key gene in regulating autophagy. Based on the previous established NTDs sample base, we found a significant maternal plasma inositol deficiency in NTDs group, and autophagy impairment. The study on inositol deficiency NTDs mouse model also showed a reduced autophagy, and an abnormal expression level of Ambra1 gene. It is still unclear that the regulation mechanism of Ambra1 gene on autophagy during embryonic neural tube development under inositol deficiency condition. In the light of the previous result, applying the method of co-immunoprecipitation，immunofluorescence, electron microscope, cell transfection and confocal microscopy etc. technique, the present program intended to study the spatio-temporal expression of Ambra1 gene during embryonic development. By knocking down or over expression Ambra1 gene in mouse neural stem cells（NE-4C）, combined by the inositol deficiency and inositol replenishing culture experiment, we plan to further investigate the regulation mechanism of Ambra1 and the key downstream gene on autophagy during embryonic neural tube development under inositol deficiency condition. It is expected to explain the pathogenesis of inositol deficiency on NTDs in vivo and in vitro, and provide the experimental evidence on inositol intervention.

肌醇缺乏是神经管畸形(NTDs)的危险因素之一。自噬在神经管形成过程中发挥重要作用，自噬/苄氯素1调节因子1（Ambra1）基因是调节自噬的关键基因。前期研究发现NTDs孕妇血浆肌醇水平显著降低，胚胎自噬受损；肌醇缺乏NTDs小鼠模型自噬受损，Ambra1基因表达改变。肌醇缺乏，Ambra1基因如何调节自噬影响神经管发育尚不清楚。本研究拟在前期基础上，利用免疫共沉、免疫荧光、共聚焦、透射电镜、GC/MS、细胞转染等技术，进一步研究肌醇缺乏NTDs人群及小鼠模型胚胎神经管发育Ambra1基因时空表达规律及其对自噬通路关键基因和自噬的作用；用小鼠神经干细胞干扰或过表达该基因，结合肌醇缺乏及回补，验证肌醇缺乏对Ambra1及自噬基因的作用；深入研究在神经管发育过程中肌醇缺乏通过Ambra1基因调控自噬关键基因引起自噬改变的分子机制，通过体内外实验从自噬新角度为肌醇干预NTDs的实施提供理论依据。

肌醇缺乏是神经管畸形(NTDs)的危险因素之一。自噬在神经管形成过程中发挥重要作用，自噬/苄氯素1调节因子1（Ambra1）基因是调节自噬的关键基因。本研究前期在NTD高发地区发现孕NTD孕妇的血浆肌醇显著降低。利用碳酸锂给予孕鼠腹腔注射，干扰体内肌醇合成关键酶IMPase，使胎鼠神经管闭合时期母体血浆肌醇水平显著降低，建立了肌醇合成障碍小鼠模型，子代小鼠NTD发生率为33.7%。本项目利用免疫组化及免疫印迹的方法，对Ambra1在肌醇缺乏NTD组及对照组脑组织中的动态表达进行分析，发现在神经管闭合时期，Ambra1基因的表达水平在肌醇缺乏NTD组显著升高，与对照组的表达规律不一致；NTD胎鼠脑组织自噬基因LC3B表达显著降低，脑组织增殖异常。在培养基中去除肌醇对小鼠神经干细胞（NE4C）进行进一步研究，发现在肌醇缺乏状态下Ambra1基因表达规律较对照组发生了改变。进一步研究发现，肌醇缺乏NE4C细胞模型中，自噬基因LC3B也表达异常，变化规律与Ambra1基因表达变化规律一致，但迟于Ambra1变化，推测肌醇缺乏可能通过影响Ambra1干扰神经管的闭合。本课题在细胞模型中发现肌醇缺乏时，AMBRA1亚细胞定位发生了改变，在肌醇缺乏状态下，Ambra1蛋白较多分布于细胞核区域，提示肌醇缺乏可以通过AMBRA1亚细胞定位改变影响自噬。根据文献检索，本研究对可能受肌醇水平影响的自噬调控通路PI3K/mTOR进行研究，发现在肌醇缺乏状态下，PI3K/mTOR通路异常激活，自噬水平降低，加入PI3K及mTOR通路抑制剂，Ambra1表达水平降低，自噬水平得到恢复。推测PI3K/mTOR通路异常激活引起的Ambra1表达增高可能参与了肌醇缺乏引起的自噬降低。本研究从自噬角度为孕期肌醇干预NTDs的机制提供实验依据，为孕期适当补充肌醇的实施提供一定供理论依据。