基于结构生物学与分子模拟方法的脂肪酶LipK107理性设计

This subject has the structure-activity relationship of enzymes as its research core. Comprehensive utilization of the structural biology, computational chemistry, molecular simulation and molecular biology, this subject makes great effort in development of new research thoughts and methods, and look forward to establish a practical approach of "rational design and improvement of enzymes". Based on the screened lipase LipK107 and operable engineering bacteria, the research group will unite X-ray crystal structure analysis, molecular docking, molecular dynamics, QM/MM, Site-directed mutagenesis etc, and draw lessons from domestic and overseas correlative literatures, in order to study the relationship between catalytic activity of LipK107 and its protein structure. Under the guidance of this result, a series of improvement schemes of catalysts with clear target will be devised. The ultimate objectives are to harvest a collection of LipK107 mutant proteins with practical value, and a set of universal strategies for rational design of catalysts. Since Aspergillales are generally regarded as safe(GRAS), therefore, E.coli is used as engineering bacteria during the lipase design and modification, then the engineering Aspergillales is constructed for protein expression. Finally, the lipase of high activity and excellent characteristics will be obtained for food industry.

本课题以酶的结构与功能对应关系为研究核心，综合结构生物学、计算化学、分子模拟、及分子生物学等多学科力量，大力开发新技术，提出新思路，以期建立起一套切实可行的"酶理性设计与改造"方法。课题组以自己筛选的LipK107脂肪酶基因为出发点，构建出可操作的基因工程菌，综合利用包括蛋白质X-ray晶体结构解析技术、分子对接、分子动力学、QM/MM、定点突变等手段在内的"湿实验"和"干实验"方法，结合国内外文献报道，确定LipK107生物催化活性与蛋白结构之间的关系。以该结构与功能关系为指导，设计出一系列目标明确的生物催化剂改造方案，并希望最终获得一系列具有应用价值的LipK107突变蛋白和一套普适性较高的生物催化剂理性设计策略。同时，通过先以大肠杆菌为宿主菌进行设计，再将其构建到符合国家食品安全标准的曲霉中的策略，获得符合食品工业生产所需的高效菌种及脂肪酶。

针对目前酶分子催化机理的认知以及功能设计改造的理论体系较为薄弱，研究手段较为缺乏等现状，本课题以脂肪酶为研究对象，对酶催化的主要决定因素、计算分析方法和设计改造策略等进行了系统的研究，并取得了一定的突破。.一，以实验室已有充分研究基础、性能优良的脂肪酶LipK107为对象，通过蛋白结晶和X-ray衍射的方法获得了其三维结构，并递交PDB数据库(PDBID：3W9U)。通过生物信息学比对和计算生物学的分析，确定了其催化中心和空间构成，以及SER79进行亲核进攻、底物酯键断裂和重构的电子转移路径，从而确定了脂肪酶LipK107的催化进程。.二，借助三维结构，结合分子对接、分子动力学、MM/PBSA三种模拟方法，设计了与盖子疏水性和电荷分布相关的多个突变蛋白。实验结果表明增强“盖子”的疏水性可将LipK107的水解比活提高13.3%，转酯活性提高51.1%，并促进脂肪酶对长链底物的选择性及其手性选择性；而降低“盖子”区域的疏水性或静电性会产生不利影响。验证了基于“盖子”结构设计改造脂肪酶策略的可靠性。.三，针对酶催化反应中“蛋白质的热稳定性”问题，采用编程语言C++完成了一套计算分析软件。基于软件分析结果进行设计改造，成功地将50˚C和 60˚C下只能保留68%和44%活力的野性型LipK107设计成可保持91%和76%活力的突变株，高温稳定性提高了近一倍。该软件为国际已有报道的第二套同类软件，同时也是唯一一套可供他人使用和代码开源的软件。为同类研究提供了良好的计算学工具。.四，针对酶催化反应中“底物的手性选择性”问题，创新性的提出了“在酶与底物结合的过程中，结合构象与结合能同样重要，都是影响底物选择的关键因素”的理论。并以脂肪酶LipK107为对象，采用新颖的电荷作用力策略，设计了一套in silicon手性选择性改造方案。经实验验证，实际偏好程度与虚拟计算结果在趋势上完全一致。为酶的底物和手性选择性的改造提供了新的策略和方法。.五，鉴于米曲霉是GRAS级别的安全菌株，将突变体脂肪酶转入米曲霉宿主，并检测到其水解活性，完成了脂肪酶在食品安全级宿主中的有效表达。.总之，本课题通过计算工具开发、计算策略发展、突变株设计和实验验证等手段，取得了大量切实可靠的结果，初步获得了一套普适性较高的酶分子理性设计策略及脂肪酶活性较高的菌株。同时，也为后续的研究者提供了研究思路和方法。